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随着我国社会老龄化的程度加剧,神经系统退行性疾病如阿尔茨海默症、痴呆等神经系统退行性疾病发病率逐渐增加,严重影响了我国老年人口的健康水平和患者家庭的生活质量。脱髓鞘是神经系统退行性疾病的最典型的共有病理表现之一,并且随着年龄增加,髓鞘再生效率下降。如果提高髓鞘的耐受和再生,可能为治疗神经系统退行性疾病、保护神经元提供新的途径。研究髓鞘形成和髓鞘再生本质就是研究少突胶质细胞的发生与调控。髓鞘的再生以及修复,主要依赖于少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cell,OPC)大量增殖及迁移到受损轴突区域,并分化成熟。星形胶质细胞(Astrocyte,AST)作为中枢神经系统数量最多、分布最广泛的一类细胞,对少突胶质前体细胞的增殖分化起着重要的调控作用。有研究表明星形胶质细胞可以为少突胶质前体细胞提供一个良好的生长环境,促进其增殖,迁移,分化,对促进髓鞘再生具有不可替代的作用。本实验通过构建星形胶质细胞与少突胶质前体细胞体外共培养模型,并利用高通量转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)分析其不同培养状态下基因组改变,旨在寻找促进少突胶质前体细胞大量增殖的靶点及其相应代谢机制,并辅以分子生物实验进行验证其代谢通路,为神经系统退行性疾病的抗脱髓鞘治疗提供理论基础。第一部分1材料与方法1.1清洁出生的SD乳鼠(1-3d),由重庆医科大学的实验动物中心提供。体外进行原代培养少突胶质前体细胞和星形胶质细胞。并分别用一抗血小板衍生生长因子ɑ受体(Platelet-derived growth factor-ɑreceptor,PDGFɑR)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)进行标记检测其生物学特性并分析纯度。1.2实验分为三组:单独培养的少突胶质前体细胞、星形胶质细胞与少突胶质前体细胞于细胞小室内共培养、星形胶质细胞与少突胶质前体细胞直接接触式共培养,通过倒置相差显微镜观察其不同时间段生长状态并随机选取5个视野进行拍照。1.3胸腺嘧啶核苷类似物(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU)对三组少突胶质前体细胞进行Apollo染色和DNA染色,通过荧光显微镜进行检测并获得图像,利用Image J软件计数并统计新生细胞数目,判断其增值能力。1.4分离纯化三组处于对数期的少突胶质前体细胞并用流式细胞仪进行检测,分析三组细胞不同培养状态下细胞周期分布。1.5分离纯化三组处于对数期的少突胶质前体细胞并送华大基因测序公司进行转录组测序,分析三组细胞与增殖相关差异表达基因及相关代谢通路1.6随机筛选接触式培养组差异表达基因,并采用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerse chain reaction,RT-PCR)分析其与单独培养组细胞的RNA相对表达量,以验证测序结果的准确性。2结果2.1少突胶质前体细胞、星形胶质细胞的特异性抗原PDGFɑR和GFAP分别标记的阳性细胞占细胞总数95%以上。少突胶质前体细胞较小,椭圆形,有2-3级突起,突起细长;星形胶质细胞与细胞核较大,胞质丰富,突起较粗而多分枝。2.2光镜观察结果表明,星形胶质细胞可以通过分泌细胞因子或缝隙连接通讯两种方式促进少突胶质前体细胞增殖,细胞数目增多,在第2-3d明显,其中,直接接触式培养组增殖作用最为明显(P<0.01)。2.3 EDU染色结果表明,两个共培养组新生少突胶质前体细胞数目均较单独培养组多,有明显差异,其中直接接触式共培养组增殖效果最明显(P<0.01)。2.4流式细胞术(Flow cytometer,FCM)分析结果表明星形胶质细胞与少突胶质前体共培养后细胞周期处于S期比例增高,以接触式培养组效果最明显,代表共培养后星形胶质细胞可以促进更多少突胶质前体细胞DNA复制,促进其增殖(P<0.05)。2.5转录组测序分析结果表明直接接触式培养组缝隙连接蛋白(Connexin,CX)CX47表达明显上调,且共培养后差异表达基因主要与细胞增殖相关。(P<0.01)2.6对RT-PCR结果中RNA表达量倍数进行统计,与转录组测序分析结果的RNA差异表达倍数相一致,证明转录组测序结果的准确性。第二部分1材料与方法1.1清洁出生的SD乳鼠(1-3d),由重庆医科大学的实验动物中心提供。体外进行原代培养少突胶质前体细胞和星形胶质细胞。并建立共培养模型。实验分四组:接触式共培养组、缝隙连接蛋白干扰对照组、缝隙连接CX47干扰组、细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)阻断剂组。并采用RT-PCR、免疫荧光(immunofluorescence,IF)、蛋白质印迹法(Western Blot,WB)筛选CX47特异性干扰RNA,采用WB检测ERK1/2阻断效果。1.2对四组少突胶质前体细胞进行Fluo-3染色,流式细胞术和激光共聚焦分析少突胶质前体细胞内钙离子相对含量。1.3 Western-blot分析四组细胞ERK1/2磷酸化程度。1.4 EDU实验对四组少突胶质前体细胞进行Apollo染色和DNA染色,通过荧光显微镜进行检测并获得图像,利用Image J软件计数并统计新生细胞数目,判断其增值能力。1.5 CCK-8实验少突胶质前体细胞进行吸光度测定,计算并比较四组少突胶质前体细胞增殖活力。1.6分离纯化四组处于对数期的少突胶质前体细胞并用流式细胞仪进行检测,分析四组细胞不同培养状态下细胞周期分布。1.7 Western-blot分析四组细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E的表达量变化。2结果2.1 CX47特异性干扰RNA序列为CCGAGAAGACTGTCTTCTT;ERK1/2阻断剂组ERK1/2磷酸化程度较其他组显著下降(P<0.05)。2.2流式细胞术和激光共聚焦分析共同表明干扰CX47后钙离子内流减少,荧光值降低(P<0.05)。2.3 Western-blot结果表明,CX47干扰组ERK1/2磷酸化下降。(P<0.01)2.4 EDU实验和CCK8实验共同表明CX47干扰组和ERK1/2阻断剂组新生细胞数目减少,细胞活力下降,增殖能力降低(P<0.05)。2.5流式分析结果表明CX47干扰组和ERK1/2阻断剂组细胞周期阻滞于G1期,S期比例显著减少,(P<0.05)。2.6 Western-blot结果表明,CX47干扰组和ERK1/2阻断剂组S期细胞周期蛋白Cyclin A表达降低,G1期蛋白Cyclin D1、Cyclin E表达量升高(P<0.01)。结论1.星形胶质细胞主要通过分泌细胞因子和缝隙连接(Gap junction,GJ)通讯两种方式以促进少突胶质前体细胞的增殖,但后者作用更显著。2.本研究将分子生物实验和转录组测序相结合,全面分析了星形胶质细胞与少突胶质前体细胞共培养后促进缝隙连接蛋白CX47表达上调,并为促进少突胶质前体细胞增殖的关键靶点。3.CX47可以调控钙信号,磷酸化ERK1/2,从而促进少突胶质前体细胞增殖。干扰RNA沉默基因CX47后,钙离子内流减少,ERK1/2磷酸化降低,少突胶质前体细胞增殖能力下降。4、CX47是通过调控钙信号通路,升高ERK1/2的磷酸化,改变细胞相关周期蛋白表达,从而促进少突胶质前体细胞增殖。干扰RNA沉默基因CX47和U0126阻断ERK1/2后,磷酸化ERK1/2降低,细胞周期S期蛋白Cyclin A的表达量下降,G1期蛋白Cyclin D1、Cyclin E表达量升高,少突胶质前体细胞增殖能力下降。