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多壁碳纳米管(mutil wall carbon nanotubes,MWCNTs)是一种重要的纳米材料,具有独特的理化性质,广泛的应用于社会各个方面。目前对于MWCNTs的研究报道也已经取得颇多的成果。现阶段有关MWCNTs的研究主要集中于MWCNTs对动物、植物以及微生物的毒性上,有关MWCNTs诱导植物不定根发生的机制的报道知之甚少。我们的实验结果表明MWCNTs能够以浓度依赖方式诱导植物不定根发生,为研究碳纳米材料在植物根系发育中的作用提供了重要的理论基础。此外,最近我们实验室发现甲烷(methane,CH4)同样能够促进黄瓜不定根的发生,但其可能的分子机制却了解不多,因此,就这些问题,展开了一系列实验研究。通过药理学、分子生物学、蛋白质翻译后修饰和遗传学试验等探索MWCNTs及CH4诱导的黄瓜不定根发生可能的作用和分子机制,取得了以下的主要结果:1、研究发现MWCNTs能以浓度依赖方式诱导黄瓜不定根发生,其中5 mg/L MWCNTs的诱导效果最佳。运用激光共聚焦和分光光度计法发现MWCNTs处理能够增加黄瓜下胚轴内源过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)的含量,对内源H2O2产生的时序变化的分析表明内源H2O2的变化存在峰值情况,并在处理12 h后达到最高峰。此外,药理学实验显示MWCNTs和H2O2的诱导作用能显著被H2O2清除剂抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)和二甲基硫腺(dimethylthiourea,DMTU)所阻断,暗示 H2O2可能参与了 MWCNTs诱导的黄瓜不定根发生。进一步实验表明,与对照相比,MWCNTs处理能够上调Rboh转录本水平,以及上调NADPH氧化酶和细胞壁POD酶的酶活,由此推测内源H2O2可能通过NADPH氧化酶和细胞壁POD酶产生。运用基于CeCl3染色的H2O2亚细胞定位实验发现MWCNTs处理也出现H2O2积累情况。采用荧光定量PCR方法证明MWCNTs和H2O2同样上调了不定根发生靶基因的转录水平,另外我们还留意到MWCNTs能通过下调生长素响应途径中miR167及上调其靶基因ARF8的转录表达水平来进一步调控MWCNTs诱导植物不定根发生。为进一步验证MWCNTs通过调控内源H202含量,从而诱导不定根的发生,本文选用了模式植物拟南芥的H2O2相关突变体AtrbohD和AtrbohF进行验证,结果发现,采用激光共聚焦和分光光度计法观察MWCNTs处理的AtrbohD和AtrbohF均不能明显促进内源H202的产生,进而不能促进不定根的发生;当外源添加H2O2却能显著逆转上述情况,揭示H202为MWCNTs促进作用的下游信号分子。上述结果表明:MWCNTs能够诱导植物不定根发生,其主要通过包括NADPH氧化酶和细胞壁POD酶调控产生的H202提高不定根产生的靶基因的表达水平以及调控miRNA的水平的变化促进植物不定根的发生。2、利用分光光度计法和激光共聚焦荧光染色分析发现CH4处理能够促进黄瓜下胚轴内源一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生,运用显微镜观察发现CH4和NO促进下胚轴根原基(adventitious root primordium,ARP)变化,并进一步诱导不定根的发生,同时以上变化能显著被NO清除剂2-(4-羧基苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧(2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide,cPTIO)及 2-苯 基-4,4,5,5-四 甲 基 咪 唑 啉-1-氧 基-3-氧(2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide,PTIO)阻断。外源添加 CH4可以一定程度上缓解上述不定根抑制情况。随后的qRT-PCR实验表明CH4和NO处理都能调节不定根产生过程中的靶基因变化,包括:CsDNAJ-1,CsCDPK1,CsCDPK5,细胞循环基因CsCDC6和两个生物素响应基因CsAux22D-like和CsAux22B-like。蛋白质翻译后修饰实验也初步证明了 CH4处理参与了蛋白质巯基亚硝基化。本研究表明:NO在CH4诱导的黄瓜不定根产生中起着信号分子作用,主要由CH4诱导内源NO产生,调控不定根产生的靶基因的表达水平以及蛋白质亚硝基化修饰来调控黄瓜不定根产生。不定根可以增大植物吸收养分的面积、支持和固定植物,同时也是重要的农艺性状。我们的研究结果表明MWCNTs和CH4可以促进不定根发生,丰富了 MWCNTs和CH4参与的复杂的信号传导网络,另外也为进一步探索新型的植物生长调节剂提供了理论基础。