背景:感染性疾病是人类面临的全球性挑战之一。由于耐药菌的广泛流行和新发病原体的不断出现,现有的抗菌药物对感染性疾病的疗效已经显得捉襟见肘。然而,新型抗感染药物的研发无论是在速度上还是种类上都很难满足临床的需要,因此亟需开发新的抗菌策略以应对日益严峻的感染性疾病的挑战。以Toll样受体(Toll-like Receptors,TLRs)为靶标的免疫调节剂已被证明可以增强宿主对病原菌的清除,表现出预防或治疗细菌感染的潜力。训练免疫是一种近年来新发现的免疫现象,也被称为固有免疫记忆,指当机体接触某些病原体或成分后,固有免疫系统被“训练”,可产生类似记忆的效应,使宿主获得增强的非特异性免疫保护能力,预防感染性疾病的发生,这尤其有助于新发感染性疾病的控制。有证据表明TLRs可能与训练免疫的建立有关,因此,TLRs配体分子可能具有良好的固有免疫增强作用,可被开发用于预防和/或治疗感染性疾病甚至新发感染性疾病。目的:肺炎链球菌肽链内切酶 O(Streptococcus pneumoniae endopeptidase O,PepO)是一种新发现的毒力蛋白,其可以通过TLR2及TLR4诱导宿主的固有免疫反应,因此可能是一种新的抗细菌感染的分子。本研究旨在探究PepO增强宿主固有免疫防御的具体效应及其分子机制,评估其作为免疫调节剂在抗细菌感染中的潜力,并探讨其发挥作用的分子机制,为以Toll样受体为靶点的免疫调节预防及治疗策略提供实验依据。方法:1.PepO通过TLR2/4受体诱导自噬增强巨噬细胞吞噬及杀菌作用用分子克隆和亲和层析纯化的方法制备PepO重组蛋白,并根据PepO的结构域预测,构建截短突变体,通过免疫共沉淀确认PepO与TLR2及TLR4的结合并确定结合位点所在的结构域。用重组蛋白处理小鼠腹腔巨噬细胞(Peritoneal Derived Macrophages,PDMs),通过免疫印迹法及免疫荧光显微分别检测PDM内的自噬标志物的表达水平及性质的改变,探究PepO对巨噬细胞自噬的诱导作用。通过同源重组法构建D39△pepO缺陷菌,比较其与野生型D39对PDM自噬的诱导作用。不同浓度PepO重组蛋白处理的PDM后,用野生型D39,铜绿假单胞菌PAK和金黄色葡萄球菌502A分别感染,不同时间裂解细胞铺板计数,计算PDM吞噬和杀菌的病原菌数量,并通过IFM检测LC3与病原菌的共定位,明确PepO诱导的自噬与巨噬细胞的吞噬及杀菌作用的相关性。用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1抑制自噬后,观察PepO作用后巨噬细胞吞噬和杀菌能力的变化,以评估PepO诱导的自噬对吞噬与杀菌作用的影响。用PepO处理tlr2缺陷、tlr4缺陷及tlr2/tlr4双缺陷的PDM,检测其吞噬杀菌作用和诱导的自噬水平,明确TLR2及TLR4在PepO诱导巨噬细胞功能增强中的作用及其与PepO诱导的自噬的相关性。通过Western blotting检测自噬相关的信号分子,分析参与自噬调控的信号通路,阐明TLR2/TLR4在PepO诱导巨噬细胞自噬中的作用。通过鼻腔给药的方式用PepO重组蛋白处理野生型、tlr2/tlr4缺陷型和巨噬细胞缺陷型小鼠后建立肺炎模型,展示PepO作为免疫调节剂在抗细菌感染中的潜力,并验证TLR2、TLR4和巨噬细胞在PepO诱导宿主抗细菌感染防御中发挥的作用。2.PepO通过糖酵解诱导训练免疫体外培养小鼠骨髓巨噬细胞(Bone Marrow Derived Macrophages,BMDM),用重组PepO蛋白处理后,检测BMDM对葡萄糖的消耗量。用PepO处理BMDM后静置3天再检测BMDM的吞噬及杀菌作用,以评估PepO对训练免疫的诱导效应。用染色质免疫共沉淀检测PepO处理后的BMDM中TNF-α和IL-6启动子区域的H3K4me3甲基化和H3K27Ac乙酰化修饰水平,验证PepO通过表观遗传重编程诱导BMDM的训练免疫。用糖酵解抑制剂阻断糖酵解过程后再用PepO对BMDM进行训练,检测TNF-α和IL-6启动子区域的表观遗传修饰水平和吞噬及杀伤作用,确认糖酵解在PepO诱导的训练免疫中的关键作用。用PepO处理tlr2基因缺陷BMDM后,检测TNF-α和IL-6启动子区域的表观遗传修饰水平和吞噬及杀伤作用,评价TLR2在PepO诱导的训练免疫中的作用。结果:1.PepO通过TLR2/4受体诱导自噬增强巨噬细胞吞噬及杀菌作用1)成功制备实验所需的重组PepO蛋白,截短突变体PepO1-430,PepO431-630重组蛋白和D39△pepO突变株。通过免疫共沉淀确认PepO及其截短突变体与TLR2及TLR4的相互作用,证明PepO与TLR2、TLR4的结合位点都在3-383的M13_N结构域。2)PepO处理小鼠PDM后,自噬标志物ULK-1、beclin 1的表达量显著上升,LC3 I向LC3 Ⅱ的转化明显增强,同时胞浆中LC3由遍布胞浆的分散分布转化为斑点状的聚集分布,提示PepO能够诱导小鼠巨噬细胞的自噬作用增强。使用IFM观察到胞浆中LC3的定位结果显示,巨噬细胞中被PDM吞噬的金黄色葡萄球菌和LC3斑点的共定位在PepO处理后显著增加(p<0.05),提示PepO诱导的自噬与吞噬作用具有相关性。用巴弗洛霉素A1抑制自噬后,PepO对巨噬细胞吞噬和杀菌作用的增强被显著减弱(p<0.05;p<0.01),同时杀菌相关的一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的活性显著降低,提示PepO诱导的自噬参与其对巨噬细胞吞噬和杀菌作用的调控。3)tlr2,tlr4及tlr2/tlr4缺陷型PDM在PepO刺激后,通过IFM观察到胞浆内LC3斑点显著少于野生型PDM(p<0.05),提示TLR2及TLR4均参与PepO对自噬诱导的调控。在PepO刺激后,自噬相关信号分子mTOR呈双相性改变,刺激早期磷酸化水平升高而刺激晚期磷酸化被抑制。而AMPK则在早期升高后恢复基线水平。因此推测在PepO诱导自噬发生的早期主要由AMPK发挥作用,而刺激晚期mTOR的作用更为重要。4)PepO处理的tlr2或tlr4单缺陷PDM,其吞噬及杀伤作用均较未处理组增强(p<0.05),但PepO处理的tlr2/tlr4双缺陷PDM的吞噬和杀菌作用相较于未处理组无显著差异(p>0.05)。tlr2/tlr4缺陷鼠在PepO处理后,肺部菌载量与PBS处理组没有显著差异(p>0.05),说明TLR2和TLR4都参与PepO诱导的巨噬细胞细菌清除能力的增强。在自噬被抑制后,PepO处理的tlr2缺陷PDM的吞噬和杀伤作用与未处理组的无显著差异(p>0.05),但tlr4缺陷PDM的吞噬和杀伤作用仍较未处理组更高(p<0.05),说明还有其他与TLR2相关的机制参与PepO诱导巨噬细胞细菌清除能力增强的过程。5)PepO处理的PDM对肺炎链球菌D39菌株,金黄色葡萄球菌502A菌株和铜绿假单胞菌PAK菌株的吞噬和杀菌作用较未处理组显著增强(p<0.05),且有剂量依赖性,提示PepO诱导的巨噬细胞细菌清除能力的增强不具有种属依赖性,可能具有广谱的抗菌作用。体内研究表明,PepO处理后,小鼠肺部肺炎链球菌D39菌株和多重耐药铜绿假单胞菌载量显著降低(p<0.05),提示PepO可增强宿主对呼吸道细菌感染的抵抗力。而在经氯磷酸脂质体清除巨噬细胞的小鼠体内,PepO处理的小鼠肺部肺炎链球菌载量与PBS处理组相比无显著差异(p>0.05),提示PepO对宿主呼吸道抗感染能力的增强依赖于巨噬细胞。2.PepO通过糖酵解诱导训练免疫1)PepO处理小鼠BMDM后,对培养基中的葡萄糖消耗量较PBS处理组显著上升(p>0.05),提示PepO参与巨噬细胞代谢的调控。2)小鼠BMDM经PepO处理后,TNF-α和IL-6启动子区域的H3K4me3甲基化修饰和H3K27Ac乙酰化修饰显著增强,提示PepO诱导了显著的表观遗传重编程;PepO处理的BMDM静置3天后,对金黄色葡萄球菌的吞噬作用显著强于PBS处理的BMDM(p<0.05),表明PepO有效地诱导了小鼠BMDM的训练免疫。3)用糖酵解抑制剂BPTES预处理BMDM以阻断糖酵解通路后,PepO处理的BMDM的吞噬作用较糖酵解正常组显著降低,同时TNF-α和IL-6启动子区域的H3K4me3甲基化修饰和H3K27Ac乙酰化修饰较糖酵解正常组显著降低,证明糖酵解参与了 PepO诱导训练免疫的过程。4)PepO对tlr2缺陷的BMDM进行训练后,巨噬细胞的吞噬作用仍部分增强(p<0.05),但吞噬作用与PBS组相比无显著差异(p>0.05),提示TLR2与PepO诱导的训练免疫建立有关;而在tlr2缺陷的BMDM中,BPTES预处理仍显著降低PepO训练对吞噬作用的增强(p<0,05),提示在TLR2之外,还存在其他机制通过糖酵解诱导训练免疫的建立。结论:本研究探索了一种TLR2/TLR4双配体蛋白PepO作为免疫调节剂增强固有免疫防御的作用及其分子机制。PepO可通过诱导巨噬细胞自噬增强其吞噬和杀菌作用,显著降低感染小鼠肺部的细菌载量,提高宿主对细菌感染的免疫力;而PepO的这种效应同时依赖于TLR2和TLR4,且不依赖于病原菌的种属,对多种病原菌的吞噬和杀菌作用均增强。另一方面,PepO通过TLR2/TLR4诱导巨噬细胞糖酵解增强,从而诱导巨噬细胞建立训练免疫,从而可长期增强固有免疫系统对侵入的病原体的反应性。以上结果表明,PepO可以显著增强宿主的固有免疫防御,是一种具有潜在治疗及预防价值的蛋白质免疫调节剂。