新城疫(Newcastle disease,ND),俗称亚洲鸡瘟,是禽类重大疫病之一,被国际兽医局列为A类传染病,人感染新城疫主要是大量接触病毒而引起结膜炎,防控新城疫在公共卫生安全上有重要意义。目前诊断新城疫有诸多方法,但随着NDV基因型的变异,现有的诊断方法已经不能满足需要,这就使得人们开始转向开发新的检测技术的研究。而光纤光栅生物传感技术是目前光学生化痕量检测的研究热点,前期本实验室已成功将光纤光栅传感器用于PCV2、NT-pro BNP的检测。本研究基于极大角度倾斜光纤光栅的基本原理,选用金葡菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)为媒介将特异性的NDV单克隆抗体固定在Ex-TFG光栅表面,初步建立一种基于极大角度倾斜光纤光栅免疫传感器,用于检测NDV,以期为新城疫的临床检测提供新的方法。本文的研究内容主要包括以下几点:1.对增殖的病毒提取RNA,通过RT-PCR法扩增出NDV-F基因,克隆到pET32a(+)载体中,构建重组质粒,转化BL21(DE3)工程菌,并经过对IPTG、温度、时间等诱导条件的摸索,确定最优诱导表达条件,利用His-tag镍柱纯化NDV-F重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。2.以新城疫全病毒和F基因重组蛋白为抗原,免疫小鼠,采用PEG1500细胞融合技术制备单克隆抗体,并对其生物特性进行鉴定;3.分别经羟基化、硅烷化、SPA敏感膜的制备、抗体固定等表面修饰初步构建极大角度倾斜光纤光栅新城疫病毒免疫传感器,用于对NDV的检测,并对其稳定性、重复性、特异性进行评价。结果:(1)诱导重组菌株表达,SDS-PAGE电泳检测,在78kDa处出现了一条目的蛋白条带,与预期相符合,且主要以包涵体的形式存在;经过对诱导条件的优化,确定在16℃、0.1mM IPTG,诱导20h时蛋白表达量最大;纯化后的重组蛋白经Western-Blot鉴定,进一步证实了其主要在78kDa左右有明显的蛋白印记条带。(2)经间接ELISA法筛选,全病毒组共获得12株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株,F基因重组蛋白组获3株阳性细胞株。SDS-PAGE电泳分析获得纯度较高的单抗,纯化后的单抗效价为1:64000,亚型主要为IgG型;Western-Blot显示,全病毒免疫制备的单抗可能针对的是NDV F蛋白;而重组蛋白免疫组制备的单抗中,可以与病毒反应,说明制备的单抗可以识别F蛋白,显示出良好的反应原性。(3)谐振波长的变化显示SPA和抗体能稳定的结合在Ex-TFG表面,设定新城疫病毒的浓度检测范围为0.05ng/m L-24ng/m L,对0-1ng/mL浓度范围内进行拟合,知其在此范围内的灵敏度为342,有良好的线性度(R2=0.982),最高检测极限为24ng/m L,最低检测极限为0.2ng/m L;重复试验显示,该传感器具有较好的稳定性,且能多次利用;特异性实验证明该制备的传感器能特异性地识别新城疫病毒,而对禽流感病毒无反应。结论:本实验初步建立了可检测新城疫病毒的极大角度倾斜光纤光栅免疫传感器,该传感器具有灵敏度高、重复性好、特异性强、实时动态检测的优点,为新城疫的临床检测提供了一种新的技术。