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肝细胞凋亡的主要通路有FasL/Fas、TRAIL/DR5和TNF-α/TNF-R,而FasL/Fas通路是介导肝细胞死亡与再生的重要通路。膜型Fas与配体FasL结合形成聚体,募集FADD(Fas-associated death domain protein)、procaspase8形成死亡诱导信号复合体(death inducing signaling complex,DISC),而procaspase8被剪接形成有活性的caspase8,释放到细胞质,再通过caspase家族的级联反应,诱导肝细胞发生凋亡。已有研究发现乙型肝炎病毒剪接蛋白(Hepatitis B spliced protein,HBSP)与乙型肝炎病毒的持续性感染及致病性有密切的相关性,并且HBSP可以促进AKT发生磷酸化,而Fas通路中的FasL、Fas聚体以及与procaspase8竞争性结合FADD的c-FLIP(FADD-like IL-1β-converting enzyme-inhibitory protein)都受AKT的调控。但目前,尚不清楚HBSP是否可以通过AKT对Fas介导的肝细胞凋亡产生影响。因此,本研究旨在研究HBSP通过AKT对Fas介导的肝细胞凋亡的影响。本文第一部分旨在探讨HBSP通过AKT对Fas介导的肝细胞凋亡的影响。首先筛选HepG2-pFlag和HepG2-pHBSP混合细胞株并通过Western Blot验证混合克隆细胞株的表达。采用CCK8和AnnexinV/PI方法分别检测细胞的活性及细胞的凋亡,结果发现HBSP通过AKT可抑制anti-Fas CH11诱导的HepG2细胞活性的下降,并抑制anti-Fas CH11诱导的HepG2细胞凋亡。本文第二部分旨在探讨HBSP对Fas通路的影响。为此,通过Western Blot检测HBSP对caspase3、caspase8以及对Fas、c-FLIP、p53和Fas聚体蛋白水平的影响,通过Real-time PCR及半定量PCR检测HBSP对Fas、c-FLIP和p53转录水平的影响;通过ELISA检测HBSP对sFas蛋白水平的影响。结果发现HBSP下调caspase3及casepase8蛋白水平。但对总Fas、mFas、sFas及P53的蛋白和mRNA水平无影响。进一步的研究发现HBSP可阻止anti-Fas CH11导致的c-FLIP下降和Fas聚体的形成,并且HBSP在转录水平阻止anti-Fas CH11导致的c-FLIP下降和FasL的表达,HBSP的这种作用可被PI3K/AKT抑制剂LY294002所逆转。为了进一步的探讨HBSP抑制Fas聚体的形成、阻止c-FLIP的下降是在DISC的水平上引起的变化。我们通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)的方法分别对FADD、Fas、procaspase8与c-FLIP之间进行相互沉淀。结果发现HBSP减少复合体DISC的形成是由于Fas聚体、procaspase-8结合到FADD减少,c-FLIP结合到FADD增多,从而引起caspase8的活化减少。本文第三部分旨在研究HBSP引起AKT磷酸化的机制。通过Western Blot检测AKT在Ser473和Thr308位点的磷酸化,以及调控AKT磷酸化的PDK1、p-PDK1、mTOR、p-mTOR(Ser2481)、PTEN蛋白的表达。结果发现HBSP促进AKT在Ser473和Thr308位点磷酸化,并且HBSP对mTOR和PDK1总量没有影响,但可以促进mTOR和PDK1发生磷酸化。PTEN负调控PI3K途径,但HBSP对PTEN没有影响。我们进而通过免疫共沉淀确定HBSP导致的mTOR、PDK1和AKT的磷酸化,是否与蛋白之间的相互作用有关,结果发现HBSP与AKT、PDK1和mTOR无相互作用。