论文部分内容阅读
目的:柑橘属理气类中药品种众多,临床用药易混淆,药材真伪难辨,道地性药材质量难以保障,严重影响中药疗效,不利于提高药材质量。本实验以柑橘属中药材广陈皮、陈皮、青皮为研究对象,采用基于分子生物学鉴定DNA条形码技术和代谢组学分析技术相结合的“双分子”鉴定技术,将DNA遗传信息差异与其表型性状主要化学成分的定性与定量分析相结合;筛选有效的的DNA条形码序列,建立准确可靠的液相-串联质谱法(LC-MS),在分子水平研究中药的种类、区别和质量差异,以期建立准确且快速区分广陈皮与陈皮、陈皮与青皮的综合方法。方法:1.通过DNA条形码技术分析广陈皮、陈皮、青皮样品的遗传信息差异:实地收集广陈皮、陈皮、青皮共81份样品为实验材料,通过植物DNA提取试剂盒法以及试剂盒改进法提取样品总DNA,比较五种DNA条形码候选片段:ITS2、ITS、psbA-trnH、rbcL、matK,以PCR扩增效率、候选序列种间变异、序列特征结构、BLAST相似性搜索算法、系统发育树等用于不同产地和栽培品种的广陈皮、陈皮、青皮的鉴定。2.基于非靶标代谢组学分析技术开展广陈皮与陈皮鉴别研究实验:采用超高效液相-四级杆串联飞行时间质谱联用(UPLC-QTOF-MS/MS)技术,获取广陈皮、陈皮的次生代谢物成分信息。建立UPLC-QTOF-MS/MS分析方法研究广陈皮与陈皮化学成分差异;色谱柱为 Waters ACQUITYTM UPLCTM HSS T3 柱(100 X 2.1 mm,1.7 μm);流动相 A为0.1%甲酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱,0-3.5 min,5-15%B相;3.5-6 min,15-25%B 相;6-15 min,25-40%B 相;15-18 min,40-55%B 相;18-20 min,55-85%B 相;20-22 min,85-95%B 相;流速为 0.2 mL·min-1;柱温为 30℃:进样量为2μL;采用电喷雾(ESI)离子源;检测模式为正负离子模式;扫描范围为m/z 100-1200;喷雾电压为4500 V;雾化温度500℃,气帘气25 psi,雾化气(GS1)50 psi;辅助加热气(GS2)50 psi,去簇电位(DP)80 V,信息依赖性扫描(IDA)参数设置:碰撞能量(CE)-35 eV,碰撞能量叠加(CES)±10 eV。整理归纳广陈皮、陈皮相关黄酮类成分质谱裂解规律,结合标准品和一般质谱学裂解规律,对广陈皮、陈皮的化学成分在线结构解析,获得次生代谢物成分信息,基于代谢组学技术的多元统计学方法,采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(0PLS-DA)对样本LC-MS数据分析,筛选出可有效区分广陈皮与陈皮的化学标志物。3.基于非靶标代谢组学技术研究陈皮与青皮的次生代谢产物差异,运用超高效液相色谱-串联四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS),建立 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS 分析方法:色谱柱为 Waters ACQUITYTM UPLCTM HSS T3柱(100 X 2.1 mm,1.7 μm);流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱,0-3 min,10-15%B相;3-15 min;15-40%B相;15-20min,40-60%B 相;20-24 min,60-85%B 相;24-27 min,85-90%B 相;27-30 min,90%B相;流速为0.2 mL·min-1,柱温为30℃;进样量为2μL;采用电喷雾(ESI)离子源;分布采用正负离子两种模式,扫描范围为m/z 100-1200主要离子源参数为鞘气(Sheath gas)40;辅助气(Aux gas)15;反吹气(Sweep gas)0;喷雾电压(Spray voltage)正离子3.5 kv,负离子2.5kv;毛细管温度(Capillary temp)350℃;辅助气加热温度(Aux gas heater temp)50℃;透镜(S-lens RF level):50。结合标准品和质谱学裂解规律,对陈皮、青皮的化学成分在线结构解析,获得次生代谢物成分结构信息。通过非靶标代谢组学分析对陈皮与青皮样本间的差异性成分的筛选,运用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)处理样本LC-MS数据,筛选出可有效区分陈皮与青皮的化学标志物。结果:1.本实验成功提取并扩增测序实验样品的五种候选序列条带,通过对五种序列条带的筛选分析,其中ITS2序列鉴别效果最佳,基于ITS2序列构建NJ进化树及二级结构结构特征差异表明新会广陈皮(茶枝柑)和其他三种来源的陈皮存有一定差异。ITS序列测序成功率低,且基于ITS序列构建的NJ进化树无法区分广陈皮与陈皮、青皮;叶绿体基因组序列(psbA-trnH、rbcL、matK)序列)较为保守,新会广陈皮及其他三种陈皮序列信息相似。陈皮、青皮样本属于同一来源不同采收期药材,同一物种的不同发育阶段的DNA条形码序列是相同的,因此同一来源的陈皮与青皮其五种DNA序列片段特征相同,DNA条形码不适用于鉴别区分二者。2.基于UPLC-QTOF-MS/MS分析技术的非靶标代谢组学分析:运用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)的多元统计学方法,建立的OPLS-DA模型能有效区分广陈皮和陈皮样品,通过对OPLS-DA模型的S-plot及变量权重VIP值进行筛选分析,经统计学检验确定具有统计学差异的化合物,根据实验测定的精确分子质量、准分子离子峰,结合二级质谱碎片及相关文献研究报道,对样品化合物成分进行鉴别,最终在正负离子模式共筛选出以多甲氧基黄酮类成分为主的34种差异化合物(VIP>1.5且P<0.05;在正离子模式下筛选得到26种差异成分,负离子模式下17种化学成分,正负离子均能检测到有9种成分)为广陈皮和陈皮样本标志性成分。3.基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS定性分析方法对陈皮与青皮的化学成分分析在正负离子扫描模式下共初步在线鉴定79种化学成分;其中74种黄酮类成分、3种柠檬苦素类成分、2种生物碱成分。最终通过非靶标代谢组学分析建立OPLS-DA模型对陈皮与青皮进行判别分析,在正负离子模式下共筛选出以多甲氧基黄酮类成分和柠檬苦素类成分为主的27种差异化合物(且VIP>1.5,P<0.05,正离子模式下成功筛选出19种差异化合物;负离子模式下14种差异化合物,正负离子模式均能检测为6种成分)为区分陈皮和青皮样本的标志性成分。结论:本实验通过基于分子生物学鉴定DNA条形码技术和代谢组学分析技术相结合的“双分子”鉴定技术,对产自广东新会茶枝柑的广陈皮样品和其他三个品种来源的陈皮样品展开研究;五种候选DNA条形码序列片段对新会广陈皮与三个其他品种陈皮(大红袍、温州蜜柑、福橘)种下品种鉴定效果不佳,通过DNA条形码难以准确鉴别区分。核基因序列ITS、ITS2序列在四个品种间的差异性较大,叶绿体基因片段(psbA-trnH、rbcL、matK)序列相对保守。结合序列扩增测序成功率和序列结构差异,单一序列鉴别以ITS2序列鉴别效果最佳,其序列二级结构及构建NJ进化树可将新会茶枝柑与温州蜜柑和福橘来源的陈皮相区分,但不能准确鉴别新会广陈皮(茶枝柑)与大红袍来源陈皮,新会广陈皮(茶枝柑)ITS2序列及其二级结构特点与其他三种来源陈皮具有差异性,可用于新会广陈皮的鉴别研究参考,但不足以实现准确鉴别新会广陈皮和三种其他来源陈皮的目的。基于代谢组学的广陈皮和陈皮实验研究中,建立的UPLC-QTOF-MS/MS样品分析方法稳定,可准确用于对实验样本的定性分析;经构建OPLS-DA模型对差异性成分的筛选并进行鉴定,确定了鉴别茶枝柑来源的广陈皮和其他品种来源的陈皮的34个差异成分,建立了一种鉴定广陈皮和陈皮的化学分类方法。因陈皮与青皮属于同源药材的不同采收期,而同一物种不同发育阶段或不同生育期之间DNA序列是一致的,所以通过DNA条形码对陈皮与青皮的鉴定失败。建立的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS分析方法可用于对陈皮青皮样本化学成分的定性分析;基于代谢组学分析采用多元统计学OPLS-DA模型筛选出可用于鉴别陈皮与青皮的27个差异化合物,建立了一种基于化学成分差异分析鉴别陈皮与青皮的分析方法。本实验通过对基于DNA条形码和代谢组学技术相结合的鉴定方法对广陈皮与陈皮、陈皮与青皮的探索性研究,可为基于DNA条形码和代谢组学技术的组合鉴定技术用于中药材鉴定提供经验参考和借鉴。