研究背景根据2012年国际癌症统计数据显示,肺癌是全球最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率居于各种恶性肿瘤之首,已成为严重危害人类健康和生命的主要疾病之一。肺癌属于肺原发性恶性肿瘤,依据临床病理学特征可以将其分为两类:小细胞肺癌和非小细胞肺癌,后者占肺癌总数的80-85%。首次确诊为非小细胞肺癌病人中,约70%的患者是肺癌中、晚期,恶性程度较高,多数病人的肿瘤己经发生了转移和扩散,因此大多数病人丧失了手术治疗的机会,这些患者主要依赖于化学药物治疗,但肺癌对化疗药物容易产生耐药性,最终导致化疗的失败。因此,寻求新的有效的治疗肺癌的药物,进一步提高临床治疗肺癌的疗效,已成为我国乃至全世界面临的紧要任务。目前,在抗肿瘤药物的研究中,主要的作用机制是通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡,以达到治疗肿瘤的作用。细胞凋亡是一个多因素参与的生理过程,涉及到基因调控和信号传导等多个过程。细胞凋亡主要通过受体介导的信号通路和非受体介导的信号通路这两条途径进行激活,前者主要通过激活细胞表面的死亡受体,后者则是通过介导线粒体的功能。细胞凋亡是肿瘤发展的一个天然屏障,而肿瘤细胞逃避细胞凋亡是人类癌症产生的根源,也是众多肿瘤出现耐药或者治疗失败的重要原因之一。近年来,研究发现许多中草药及其主要成分能够诱导肿瘤细胞凋亡,在体内和体外实验中都能够很好的抑制肿瘤细胞的生长,可以有效的达到抗肿瘤的目的,因而通过诱导肿瘤细胞凋亡的方式来筛选具有抗肿瘤作用的中草药是一个高效的实验方法。重楼(Rhizoma Paridis)是中医中药抗癌配方中常用的药物,其应用已有上千年的历史。重楼的主要活性物质是甾体皂苷,具有抗肿瘤、抗菌消炎、止血、抗氧化、免疫调节等多种药理作用。而重楼皂苷Ⅵ(polyphyllin Ⅵ,PⅥ)和重楼皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ,PⅦ)是从中药重楼中提取出来的甾体皂苷类单体物质,具有非常强的抑制肿瘤细胞增殖的活性。尽管有研究表明,PⅦ能够在体外能够抑制HepG2,MCF-7,PC-3等肿瘤细胞的生长,以及能够抑制体内HepG2裸鼠移植瘤的生长,然而PⅥ和PⅦ对非小细胞肺癌在体内和体外的抗肿瘤活性及其机制的研究很少。在我们的前期实验中发现PⅥ和PⅦ能够抑制人非小细胞肺癌A549细胞和NCI-H1299细胞的增殖,但是目前我们仍不知道PⅥ和PⅦ是通过调节哪些蛋白或信号通路抑制了人非小细胞肺癌A549和NCI-H1299细胞的生长和增殖,以及PⅥ和PⅦ在体内是否也能抑制A549移植瘤的生长。因此,我们将开展一系列试验以阐明PⅥ和PⅦ的抗非小细胞肺癌的作用。研究目的本文研究的目的在于考察PⅥ和PⅦ对人非小细胞肺癌A549和NCI-H1299细胞增殖的影响,并探讨其在体外抗非小细胞肺癌的作用及其机制;并且通过建立A549裸鼠移植瘤模型,进一步研究PⅥ和PⅦ在体内的抗肿瘤活性及其机制。这些发现有利于我们全面的了解PⅥ和PⅦ的抗肺癌作用及其机制,从而为PⅥ和PⅦ的新药开发及临床应用提供更深入的理论依据。研究方法本研究将通过MTT法,流式细胞仪检测细胞凋亡、流式细胞仪检测细胞周期阻滞、western blotting和建立移植瘤模型等技术,深入研究PⅥ和PⅦ在体外和体内的抗肿瘤作用及其机制。1.MTT法检测细胞活力取对数生长期的肿瘤细胞,以3000/孔接种于96孔培养板中,培养过夜,细胞生长状态良好后,弃去原有的培养基,然后按照设计的药物浓度:重楼皂苷V、重楼皂苷H、纤细薯蓣皂苷、CL-8、PⅥ和PⅦ以0,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5 μM分别作用于A549细胞48 h后停止培养;以及PⅥ和PⅦ以0,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5 μM 作用于 A549 和 NCI-H1299 细胞 24,48,72 h后停止培养;然后加入0.5 mg/ml的MTT溶液,处理4 h后,弃上清,最后加入150 μl DMSO振荡混匀,置于酶标仪中测定其吸光度值(测定波长为570 nm)。2.流式细胞仪检测PⅥ和PⅦ的细胞周期阻滞情况取对数生长期A549和NCI-H1299细胞,以2 × 105/孔接种于六孔培养板中,培养过夜,弃去培养基,加入PⅥ(0,1,2,4μM)和PⅦ(0,0.5,1,2 μM),处理细胞24 h后;用胰酶消化、收集细胞、离心、PBS清洗2次,再用预冷的体积分数为75%乙醇溶液混悬细胞,密封保存后置于4℃冰箱过夜。次日,离心,PBS洗1次,接着每管细胞中加入500 μl PBS溶液(含有25μl PI(1 mg/ml)和0.5 μl RNA酶(10 mg/ml),涡旋混匀,然后将细胞置于37℃避光孵育30 min,充分混匀后,采用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况,样品于1 h内检测完毕。3.流式细胞仪检测PⅥ和PⅦ的细胞凋亡情况取对数生长期A549和NCI-H1299细胞,以2 × 105/孔接种于六孔培养板中,培养过夜,弃去培养基,加入PⅥ(0,1,2,4μM)和PⅦ(0,0.5,1,2 μM)处理细胞48 h后,消化、收集细胞、离心、PBS清洗2次,倒掉上清液,用滤纸倒扣滤干;再用凋亡试剂盒中的1 × Binding Buffer 100μl/Tube悬浮细胞,然后加入Annexin-FITC和PI各5μl/Tube,避光,室温放置15 min;最后再分别加入400 μl/Tube的1 × Binding Buffer,充分混匀后,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,样品于1h内检测完毕。4.Western blotting法检测细胞凋亡和G2/M检查点相关蛋白PⅥ(0,1,2,4 μM)和 PⅦ(0,0.5,1,2μM)分别与 A549 和 NCI-H1299细胞共同孵育48 h后,胰酶消化、收集细胞,用RIPA裂解液提取总蛋白,然后进行蛋白定量。采用western blotting检测细胞凋亡相关蛋白Fas,DR3,DR5,DcR3,PARP,Cleaved PARP,Cleaved Caspase-3,及 G2/M 检查点相关蛋白 Cyclin B1的表达情况。5.建立裸鼠移植瘤模型研究PⅥ和PⅦ对移植瘤生长的影响建立人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型:选用4到6周的雌性BALB/c nu/nu小鼠,将肿瘤细胞制成悬液,然后按照细胞数为2 × 106/只接种于裸鼠的右侧腋窝下。每周称量2～3次体重和用游标卡尺测量2～3次肿瘤的大小。然后按照以下公式计算肿瘤体积:Tumor Volume(TV)=1/2 ×(L × W2),其中L是肿瘤纵轴的长度,W是肿瘤横轴的长度,并绘制裸鼠肿瘤的生长曲线。当肿瘤的平均体积达到约100 mm3时,将裸鼠随机分为8个组,每组8只。按照如下方案给药:空白对照组(0.9%生理盐水);PⅥ的高、中、低剂量组(4、3、2 mg/kg);PⅦ的高、中、低剂量组(3、2、1 mg/kg);阳性对照组(环磷酰胺,25 mg/kg)。裸鼠每周腹腔注射给药5次,持续给药4周。给药结束后,处死裸鼠,然后取出肿瘤组织冻存于-80℃。部分肿瘤组织用RIPA裂解液裂解提取总蛋白,然后进行蛋白定量。采用western blotting方法检测细胞凋亡相关蛋白DR3,DR5和G2/M检查点相关蛋白Cyclin B1的表达情况。6.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。数据作图采用GraphPad Prism 5.0数据分析软件,数据结果以Mean±SD表示;多组间均数比较采用单因素方差分析(Oneway-ANOVA),P<0.05认为具有统计学显著性差异。实验结果1.重楼单体对肺癌细胞生长的的抑制作用采用MTT法检测6种重楼单体对A549细胞的抑制作用,结果显示PⅥ和PⅦ对A549肺癌细胞的生长抑制最强。而且PⅥ和PⅦ对A549和NCI-H1299细胞具有浓度依赖性的抑制作用;给药24,48和72h后,在A549细胞中PⅥ的 IC50 值分别为 4.63 ± 0.58 μM,4.53 ± 0.56 μM,4.24±0.59 μM,而 PⅦ 的 IC50值则分别是1.80±0.14 μM,1.59±0.12 μM,1.52±0.20 μM;在NCI-H1299 细胞中 PⅥ 的 IC50 值分另为 5.64±0.65 μM,5.46±0.45 μM,5.54 ± 0.91μM,而PⅦ 的IC50值则分别是 2.08±0.05μM,1.87±0.09 μM,1.71±0.25μM。从 IC50值可得知PⅥ和PⅦ能显著性抑制A549和NCI-H1299细胞的生长和增殖。2.PⅥ和PⅦ使细胞阻滞在G2/M期流式细胞仪检测细胞周期阻滞的结果显示,与对照组相比,经不同浓度的PⅥ和PⅦ处理的A549和NCI-H1299-细胞,其G2/M期细胞的比率随着浓度的增加而显著性增加,即PⅥ和PⅦ能够促使A549和NCI-H1299细胞阻滞在G2/M期。同时,采用western bloting检测细胞周期相关蛋白的结果显示,PⅥ和PⅦ在高浓度时能显著性降低A549和NCI-H1299细胞中Cyclin B1的蛋白表达水平。3.PⅥ和PⅦ诱导细胞发生凋亡Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡的结果显示,与对照组相比,经不同浓度组的PⅥ和PⅦ处理的A549和NCI-H1299细胞,随着浓度的增加,其Annexin V-FITC 阳性细胞的比率显著性增加。这结果提示PⅥ和PⅦ对A549和NCI-H1299细胞的增殖抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。同时,western blotting检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况显示,随着浓度的增加,PⅥ和PⅦ能够显著性上调A549和NCI-H1299细胞中Fas,DR3,DR5,PARP,Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,显著性降低DcR3的蛋白表达水平。4.PⅥ和PⅦ抑制A549裸鼠移植瘤在A549裸鼠移植瘤模型的实验中,结果显示A549细胞移植瘤的成瘤率为100%,以及PⅥ和PⅦ能够显著性抑制体内肿瘤的生长。与空白组比较,PⅥ和PⅦ的低、中、高剂量组对移植瘤的抑制作用均有显著性差异。PⅥ的低、中、高剂量组的抑制率分别为25.74%,34.62%和40.43%;而PⅦ的低、中、高剂量组的抑制率则是25.63%,41.71%和40.41%。实验过程中,各组裸鼠间体重无显著性差异。Western blotting结果显示,PⅥ和PⅦ能够上调相关蛋白DR3和DR5蛋白的表达水平,却降低了 Cyclin B1蛋白的表达水平。主要结论综上所述,我们的研究证实了 PⅥ和PⅦ可在体内外抑制非小细胞肺癌的增殖,阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡。1.6种重楼单体对A549肺癌细胞均有一定的抑制作用,其中,PⅥ和PⅦ对A549细胞的抑制作用最强。而且PⅥ和PⅦ均能够显著性抑制A549和NCI-H1299细胞的生长和增殖。2.PⅥ和PⅦ使A549和NCI-H1299细胞阻滞在G2/M期,同时能够显著性降低这两个细胞中的Cyclin B1的蛋白表达水平。3.PⅥ和PⅦ诱导A549和NCI-H1299细胞发生凋亡,其凋亡率随着浓度的增加而显著性增加;并上调了这两个细胞中的Fas、DR3、DR5,Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平,降低DcR3的蛋白表达水平。4.PⅥ和PⅦ能够显著性抑制A549裸鼠移植瘤的生长,具有体内抗肿瘤活性。Western blotting的结果同样显示PⅥ和PⅦ可能通过调控细胞周期G2/M期和细胞凋亡中死亡受体通路蛋白的表达水平而抑制了肿瘤的生长和增殖。