论文部分内容阅读
鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳球虫引起以肠道病变为主要特征的细胞内寄生虫病,呈世界性分布,严重危害养鸡业的发展。其中尤以柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)引起的危害最为严重。端粒(Telomere)是真核生物染色体末端能够防止染色体末端融合、降解和重组的特殊核蛋白复合体。端粒酶(Telomerase)是一种核糖核蛋白,能以自身携带的RNA为模板,不断合成新的端粒DNA序列添加到染色体末端以维持染色体端粒长度。目前,有关端粒和端粒酶的研究已经成为生命科学研究的热点之一。而寄生虫防治过程中存在的一个非常棘手的问题就是耐药虫体和虫株的不断出现,严重影响抗寄生虫药和驱虫药的效果。以寄生虫的端粒和端粒酶为切入点,进而分离端粒结合蛋白并针对该蛋白设计药物或疫苗无疑为寄生虫病的预防和治疗开辟了新思路。本研究以E.tenella为研究对象,应用单卵囊分离技术成功分离具有较强感染力的地方分离株。在此基础上,成功构建了富含端粒序列文库,进一步通过Southern杂交和酶切筛选阳性克隆,确定了E.tenella端粒DNA重复序列为5’-TTTAGGG-3’。采用CODEHOP方法根据已登录GenBank其他球虫目原虫端粒酶逆转录酶(TERT)基因序列设计简并引物PCR同时结合3’、5’-RACE技术,成功克隆E.tenella TERT 4688bp全长cDNA序列,其中包括4491bp的ORF编码1497个氨基酸,同时含有42bp 5’UTR和152bp 3’UTR以及多聚腺苷酸尾。利用生物信息学分析软件分析表明该基因包含TERT家族的主要特征性基序。最后采用改进TRAP法检测了E.tenella未孢子化卵囊、子孢子和裂殖子端粒酶活性,结果显示子孢子和裂殖子具有较高的端粒酶活性。本研究为进一步深入探索球虫端粒形成、端粒酶活性调控、基因表达和变异、细胞周期调节等机制并针对端粒结合蛋白设计特异抗球虫靶向药物预防和治疗球虫病奠定了基础。