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细胞核因子-κB (Nuclear factor κappa B)是一种较特殊的转录调节因子,普遍存在于真核细胞内,对宿主先天性免疫反应及细胞增殖、分化和凋亡起到关键的调节作用。细胞核转录因子-κB可以通过调控相关靶基因的转录与表达,参与机体的多种生理活动,当机体感染细菌或病毒等致病因素,其信号通路将在一系列酶的作用下被激活,参与宿主的免疫应答,它的异常活化可能是PRV导致免疫抑制的重要原因。为获得猪NF-κB C-Rel亚基序列特性,对PRV感染导致的免疫抑制与NF-κB表达异常的关联性进行研究,本试验通过NCBI GeneBank中猪核转录因子-κB C-Rel亚基序列(XM 003125115)设计特异性引物,对NF-κB C-Rel全序列进行克隆、序列鉴定及生物信息学分析；对PRV感染PK-15细胞对C-Rel转录时相的影响进行分析；并构建NF-κB C-Rel真核表达载体,对NF-κB C-Rel亚基真核表达产物对PRV复制的影响进行探讨,结果如下：1.猪核转录因子NF-κB C-Rel亚基的克隆及序列鉴定本实验采用RT-PCR方法从猪外周血淋巴细胞中扩增到NF-κB C-Rel ORF区并克隆至pMD19-T simple vector,克隆获得阳性质粒后测序,进行相关生物信息学分析。序列分析结果表明：所扩增猪C-Rel亚基ORF长1773 bp,编码590 aa；猪C-Rel核苷酸序列与不同动物的C-Rel核苷酸序列相似性较高；大部分位于细胞核(76.0%)内,无信号肽及跨膜区。2.PRV感染PK-15细胞对NF-κB C-Rel亚基mRNA转录时相的影响分析本实验成功构建了NF-κB C-Rel亚基基因的荧定量检测方法；运用此方法对PK-15细胞感染PRV后,不同时段的细胞中C-Rel亚基mRNA转录情况进行测定并分析。结果表明：标准品拷贝数在一定的浓度范围内有极好的线性关系,相关系数达到0.998,扩增效率为103.8%；特异性强,扩增产物形成单一的特异性融解峰；灵敏性高,能检出102copies/ul的标准质粒；重复性好,组内变异系数较小。PK-15感染PRV后,与对照组相比：0～4 h, C-Rel转录水平下调,在2h和4h差异显著(P<0.05); 4～12 h, C-Rel转录水平快速上调,12h达到转录高峰(P<0.01)；12h后C-Rel转录水平逐渐下降,24～120 h,均维持在较低水平,其中36h差异极显著(P<0.01),48 h,72 h和120 h差异显著(P<0.05)。可见,PRV的感染会导致PK-15细胞中NF-κB活化水平的降低,这与目前的相关研究结果基本相符。3.猪NF-κappaB C-Rel亚基真核表达载体的构建及C-Rel/P50/P65转染BHK21细胞对PRV增殖的影响本实验为了研究不同NF-κB (C-Rel/P65/P50)对PRV增殖的影响,成功构建了pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表达载体,与本实验室已构建的P50,P65真核表达载体两两组合,应用脂质体法转染BHK21细胞,C-Rel、P50、P65亚基的表达水平通过Westem-blot法被成功检测；将pCDNA3.1(+)空载体、pCDNA3.1(+)-C-Rel、pCDNA3.1(+)-C-Rel+pCDNA3.1(+)-P65 pCDNA3.1 (+)-C-Rel+pCDN A3.1 (+)-P50-RHD分别转染至BHK21细胞,转染14h后接种PRV,应用本实验构建的PRV gE基因荧光定量PCR方法,对细胞上清中病毒粒子增殖时相进行检测,绘制PRV一步生长曲线。本实验成功构建了猪pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表达载体,且能够在BHK21细胞中表达；转染C-Rel/C-Rel、 C-Rel/P50-RHD、C-Re/P65真核表达质粒均能促进细胞病变的提前出现；由各转染组PRV一步生长曲线结果可知,C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65能有效减缓PRV在BHK21细胞上增殖的进程,其中,C-Rel/P65的抑制作用更强。可见,NF-κB C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65二聚体能在一定程度上抑制PRV在BHK21细胞中的增殖。