Eph家族受体是最多的一类酪氨酸激酶受体蛋白,Eph通过与表达其配体Ephrin的邻近细胞相互作用发挥双向信号转导功能。Ephrin-Eph介导的信号通路通过调节下游Rho GTPase的活性调控细胞骨架动态变化,在细胞迁移、细胞黏连、细胞极性、细胞形态等多个过程发挥重要作用。Ephexin(Eph-interacting exchange protein)家族蛋白作为Ephrin-Eph通路下游重要的Dbl(diffuse B-cell-lymphoma)类鸟苷酸交换因子,能够激活Rho GTPase活性调控细胞骨架的重塑,在细胞增殖与迁移、细胞分化、神经发育及信号转导、代谢平衡等过程中具有关键的功能。研究表明,编码Ephexin家族蛋白的基因突变与肿瘤的发生发展及神经系统疾病密切相关。Ephexin家族蛋白包含5个成员(Ephexin1-5)。为了实现Rho GTPase时空尺度上的精准调控,Ephexin家族蛋白可以选择自抑制和激活两种构象状态。除了 Ephexin5,Ephexin1-4 都含有一个 DH-PH(Dbl homology-Pleckstrin homology)催化结构域,一个羧基端的SH3(Src homology 3)结构域。有报道称,去掉羧基端的SH3结构域能够大大增强Ephexin4的酶活,提示SH3结构域能够抑制Ephexin4的催化活性。SH3结构域介导的自抑制现象在Ephexin1和Ephexin3中也存在。更为有趣的是,在Ephexin1-3的DH结构域之前有一段保守的α螺旋多肽片段(IH,inhibitory helix)也能够抑制其RhoGEF催化活性。上述研究提示,Ephexin家族蛋白的活性调控模式可能包含多重自抑制和激活模式,但分子机制尚不明确。在本论文中,我们详细研究了 Ephexin4的双重自抑制构象。我们解析了:1)Ephexin4的SH3结构域介导的羧基端单抑制状态晶体结构,主要包括DH-PH结构域、SH3结构域以及羧基端一段α螺旋(C-terminal helix,HC)[简称DPSH];2)Ephexin4的双重抑制状态的晶体结构,主要包括DPSH的羧基端抑制构象以及IH多肽介导的氨基端自抑制构象[简称IDPSH]。通过结构分析和体外GEF酶活实验,我们确认了双重自抑制界面的关键氨基酸残基,其突变体(如C端的R706D,N端的Y220D等)能够有效的激活Ephexin4的催化活性。重要的是,我们的研究发现R706L这一在精原细胞瘤病人中被报道突变体能够激活Ephexin4的催化活性,为相关疾病的发病机制提供可能的结构依据。结构及序列分析还提示,Ephexin4的双重自抑制构象在其他Ephexin家族蛋白中可能是保守的。体外酶活实验证实,Ephexin1也具有类似的双重自抑制构象。此外,我们预测并证实另一个与Ephexin4序列和结构类似的RhoGEF-SGEF(ARHGEF26)也处于双重自抑制状态。Ephexin4的双重自抑制状态是如何被激活的?我们发现DLG1的PDZ结构域(PDZ1或PDZ2)能够结合Ephexin4羧基端的PDZ结构域结合序列(PDZ binding motif,PBM),这一相互作用能够激活Ephexin4对RhoG的催化活性。通过结构分析,我们发现PBM距离SH3-HC这一C端自抑制模块很近。我们推测并证实该激活机制是因为DLG1 PDZ和Ephexin4 PBM之间的相互作用使得DH与SH3-HC的自抑制相互作用因位阻效应而解除了,从而允许RhoG进入并结合DH结构域,发生催化反应。在研究IH介导的氨基端自抑制激活机制中,我们发现将IH抑制多肽中保守的酪氨酸残基Y220突变为天冬氨酸后(Y220D),能够有效的激活Ephexin4的活性,提示该位点的磷酸化是激活氨基端自抑制的可能机制。进一步,我们通过细胞迁移实验,在细胞层次证实了Ephexin4的双重自抑制及其激活的分子机制。有趣的是,我们发现Ephexin4的双重自抑制之间是互不影响的,即解除其中一个自抑制并不会影响另一个的抑制状态,这就为Ephexin4响应不同层次的信号转导提供了可能。综上,我们综合运用生物化学、结构生物学、细胞生物学等方法详细阐释了 Ephexin家族RhoGEF双重自抑制及激活的分子机理,展示了 Ephexin4受多层次调控的工作机制,并为疾病相关突变提供了可能的致病机制,为后续相关药物开发提供了基础。