流行病学调查及实验研究表明，盐作为重要的环境因素与高血压的发生发展密切相关。20世纪70年代末Kawasaki和Luft提出了“血压的盐敏感性(salt—sensitive)”概念，定义为：相对高盐摄入所引起的血压升高。盐敏感性者细胞膜Na+转运缺陷是其主要发生机制，高盐摄入直接导致钠潴留，引起血容量过负荷，从而导致血压升高。水钠潴留是引起高血压的重要机制，一直深受国内外学者关注，从肾小管离子通道去探讨高血压的盐敏感性发生机制近年来取得了长足进展。 上皮钠通道(Epithelial sodium channel，ENaC)是非电压门控的阿米洛利敏感性异侧离子通道，广泛存在于多个组织器官，对Na+有高度特异性，可使Na+通过下调自身电化学梯度进入细胞。功能性表达及生化资料显示，ENaC是一种跨膜蛋白，有3个同源的亚单位：α、β和γ—ENaC。大量研究证实，γ—ENaC是肾脏ENaC发挥主要调节作用的亚单位。 内髓集合管(Inner medullary collecting duct，IMCD)是哺乳动物集合管的终末部位，为控制Na+排泄的最后节段。IMCD中直接参与渗透平衡和酸碱平衡调节的是IMCD细胞。ENaC在肾脏主要分布在远曲小管和集合管，而IMCD管腔侧ENaC在维持机体对Na+的重吸收、体液平衡及血压调节中起着关键作用。临床和基础研究均发现，IMCD中ENaC活性增加导致的水钠潴留是高血压盐敏感性发生机制的关键环节。已经证实ENaC基因变异可导致遗传性高血压或低血压。尽管目前ENaC的调控机制尚不清楚，寻找IMCD中ENaC的调控因子一直是本领域的研究热点。 EETs(环氧二十碳烯酸，Epoxyeicosatrienoic acids)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)主要通过细胞色素P—450(cytochrome P—450，简称CYP)表氧化反应生成的产物，包括5，6-，8，9-，11，12-和14，15-EET。CYP2C23是大鼠肾脏CYP主要亚型。EETs可以直接扩张血管因而具有很强的调控血压效应，被认为是内皮源性超极化因子(endothelium—derived hyperpolarizing factors，EDHFs)，其扩血管效应在高血压的病理生理作用已得到肯定。近年研究还发现EETs对多种离子通道，包括Na+通道具有调控效应。已经证实EETs可以通过在肾脏促进尿钠排泄而达到调控血压效应，而这一效应是通过调节肾脏集合管ENaC转运能力来实现的。EETs对ENaC活性的调控作用是当前研究热点，但国内相关研究甚少。 此外IMCD处于全身渗透压变化跨度最大的肾脏内髓组织，其中Na+是构成渗透压的重要因素。ENaC活性改变会直接影响细胞膜两侧Na+浓度，有研究表明ENaC可能受细胞内Na+反馈性调节；IMCD细胞中ENaC的存在已经被证实，但细胞外Na+对IMCD细胞ENaC表达是否有影响，国内外报道甚少。以往对ENaC的研究大都建立在动物模型基础上，或采用微穿刺和微灌注等方法来探讨EETs对肾脏ENaC活性的调控作用；但由于肾小管的不同节段对钠离子的调控作用不同，且涉及多种离子通道；既往研究大多集中在皮质肾小管，而相关的体外研究EETs对IMCD细胞ENaC活性的调控作用国内外还尚属空白，因此本实验旨在探讨EETs和不同氯化钠渗透压环境对体外培养的原代IMCD细胞ENaC的调控作用。 第1章不同渗透压环境对IMCD细胞增殖活性和ENaC表达的影响 研究目的：探讨不同渗透压环境对大鼠IMCD细胞增殖活性和ENaC表达的影响。 材料与方法： 1.采用胶原酶消化和低渗溶解法分离培养雄性SD大鼠原代IMCD细胞，予含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱内培养。所有实验均取第二代对数生长期细胞。用免疫荧光技术检测IMCD细胞中α、β和γ—ENaC的表达部位。 2.模拟IMCD细胞的体内环境，通过增加细胞外液中Na+浓度造成高渗环境，降低Na+浓度造成低渗环境。IMCD细胞在正常培养基中生长72h(融合至80％以上)后，分为三组，分别更换培养基为低渗培养基(200mOsmol/kgH2O，等渗培养基+纯水)，等渗培养基(300mOsmol/kgH2O，普通DMEM/F12培养液)或高渗培养基(600mOsmol/kgH2O，等渗培养基+9％NaCl)；三种培养基胎牛血清终浓度均为10％。在12h和24h分别应用MTT法(噻唑蓝)检测活细胞数目、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，评价IMCD细胞的渗透压耐受性，并分别收集各组细胞蛋白用Western Blot法(免疫印迹法，简称WB法)半定量检测β—ENaC和γ—ENaC的表达水平。WB结果用凝胶图象处理系统Quantity One4.4.0对胶片进行扫描测量感光区带的感光密度，并进行积分处理。 结论： 1.高渗环境可以抑制IMCD细胞增殖，诱导其凋亡，12h作用较显著；而24h时低渗环境对IMCD细胞的抑制增殖和诱导凋亡效应增加； 2.细胞外氯化钠渗透压的改变不能调控IMCD细胞ENaC表达。 第2章 EETs对IMCD细胞ENaC表达的调控作用 研究目的：探讨外源性11，12-EET和CYP2C23-EGFP重组腺病毒转染对大鼠IMCD细胞γ-ENaC表达的影响，旨在为EETs调节机体水钠负荷和血压盐敏感性提供实验基础和理沦依据。 材料与方法： SD大鼠原代IMCD细胞培养：参见第1章。 外源性11，12-EET：购自美国sigma公司，100ug/ml，纯度：98％。 CYP2C23-EGFP重组腺病毒：1×1012VP/ml，大鼠源性的CYP2C23-pBluescript SK+/-，由QBIOgene公司完成克隆载体CYP2C23-IRES2-EGFP的构建、鉴定，以及感染HEK293细胞后扩增、CsC1密度梯度超速离心纯化。 1.外源性11，12-EET干预实验：将IMCD细胞按1.0×106cell/孔接种于6孔板中，在正常培养基中培养至融合80％以上后使用，设实验组(三组，11，12-EET不同浓度)和空白对照组(正常培养基)，实验组按终浓度为10ng/ml、100ng/ml与1000ng/ml分别更换为5ml含有11，12-EET的DMEM/F12培养基，各组培养基中胎牛血清终浓度均为10％，并继续置于37℃、5％CO2培养箱内培养。在12h和24h分别收集细胞蛋白，WB法半定量检测各组β-ENaC和γ-ENaC的表达水平。 2.CYP2C23-EGFP重组腺病毒转染IMCD细胞实验：将IMCD细胞按1.0×106 cell/孔接种于6孔板中，培养至60％-70％左右融合时使用，设实验组(三组，CYP2C23-EGFP不同转染滴度)和对照组(高滴度对照腺病毒：购自QBIOgene公司，不含有CYP2C23和EGFP)，实验组按0.4×109、2.0×109与4.0×109的病毒颗粒分别加入5ml含有CYP2C23-EGFP重组腺病毒的DMEM/F12培养基，对照组加入5ml含对照腺病毒颗粒4.0×109的DMEM/F12培养基，各组培养基中胎牛血清终浓度均为5％，并继续置于37℃、5％CO2培养箱内培养。在12h和24h，荧光倒置显微镜下观察CYP2C23-EGFP重组腺病毒转染IMCD细胞后的荧光表达强度，荧光强度平均积分光密度使用Image-Pro Plus6.0软件定量分析。病毒转染滴度与转染细胞荧光表达强度的相关性分析采用Spearman等级相关。高倍镜下计算各组病毒体外转染率，并分别收集各组细胞蛋白，WB法半定量检测各组γ-ENaC的表达水平。 结论： 1.100ng/ml11，12-EET对IMCD细胞γ—ENaC表达有抑制效应，增加剂量和延长作用时间此抑制效应无显著差异； 2.CYP2C23-EGFP重组腺病毒成功转染IMCD细胞后上调EETs表达，对IMCD细胞γ—ENaC表达有抑制效应。