论文部分内容阅读
前言： 脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是临床脊柱外科的常见病种，发病率呈逐年增加趋势。SCI病理过程涉及能量代谢障碍、氧化应激、炎症发生、细胞凋亡、神经营养因子缺失、兴奋性毒作用等多个环节，其病理机制复杂。SCI包括原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤不可逆，无法对其进行有效的治疗，继发性损伤是指伤后几小时至几天脊髓损伤局部原来正常的组织发生自身破坏性病变，如电解质失衡、局部血流量改变、Ca2+介导的细胞损伤、自由基生成、谷氨酸诱导的兴奋性中毒、线粒体功能紊乱、炎性因子生成及细胞凋亡等，其造成的损害超过原发性损伤，目前脊髓损伤的研究主要集中在脊髓损伤后脊髓内继发病理损伤的预防和逆转。 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种调节红细胞生成的激素，是促进哺乳动物红系祖细胞增殖和分化的主要细胞因子，能够与EPOR结合发挥器官保护、免疫调理、抗炎、抗凋亡、神经保护等非促红细胞生成作用，最近研究显示，EPO可在多种细胞和组织中发挥细胞保护作用。利用动物实验对EPO在脊髓损伤的作用机制研究中发现，EPO能提供神经再生和神经保护作用，临床试验也证实了这点。 磷脂酰肌醇（-3）激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3 kinase/proteinkinase B，PI3K/Akt)信号通路是体内非常重要的一个信号通路，能够调节细胞凋亡、葡萄糖代谢及蛋白质合成等过程。有研究发现，EPO能够通过调节P13K/Akt信号通路参与神经及心肌保护作用，其可能的机制是EPO激活P13K后，活化Akt，Akt通过磷酸化其下游的底物（如Bad，p53，caspase-9和GSK-3β等），进一步激活多种细胞内信号转导通路，继而发挥多重生物学效应，包括抗凋亡、抗炎、调节细胞增殖分化等。但是在脊髓损伤后，EPO能否通过激活P13K/Akt信号通路调节脊髓损伤尚不清楚，仍需进一步研究。 本实验选取成年健康Wistar大鼠72只，雌雄不限，按随机数字法分为假手术组、脊髓损伤组和重组人促红细胞生成素治疗组，参照Nystroms压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型，按照存活时间再分为脊髓损伤6h、12h、1d、3d四个亚组。利用免疫组织化学方法和Western blot方法检测Akt、p-Akt蛋白在各组大鼠脊髓损伤部位表达的变化，探讨促红细胞生成素治疗脊髓损伤的病理作用机制。 材料和方法： 一、实验材料 1、实验动物本实验选取成年健康Wistar大鼠72只，雌雄不限，由中国医科大学实验动物中心提供，体重在220-250 g。 2、主要试剂兔抗大鼠Akt、p-Akt抗体，购自Santa公司;辣根过氧化物酶结合羊抗兔免疫球蛋白和S-P法免疫组化试剂盒，β-actin，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二次抗体，FITC标记的山羊抗兔二次抗体均购，购自中杉金桥生物技术有限公司。 3、主要仪器电热恒温干燥箱;电子分析天平;恒温水浴箱;低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;正置荧光显微镜;-80度深低温冰箱;恒温冰冻切片机;Motic Images Advanced3.2图象分析系统。 二、实验方法 1、制备脊髓损伤模型参照Nystroms压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型。 2、免疫组织化学检测各组大鼠脊髓损伤部位Akt和p-Akt的表达。 3、Western blot方法检测各组大鼠脊髓损伤部位Akt和p-Akt的表达。 4、图象分析 Western blot结果用Chemi Imager5500V2.03软件扫描，用Fluor Chen2.0软件定量分析显色带的 MOD值。免疫组化结果用Motic ImagesAdvanced3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。 5、统计学处理 所有数值均以均数±标准差表示，实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，组间比较进行t检验。 三、实验结果 （一）Akt检测结果 1、免疫组织化学结果 在假手术组大鼠的脊髓组织中可发现大量的Akt蛋白阳性表达细胞，脊髓损伤后Akt阳性表达细胞数迅速降低，在脊髓损伤后24 h时Akt表达的细胞数最低，3d时略有上升，与假手术组相比显著降低（P＜0.05）;rHuEPO治疗组6h、12h、24h、72h时间点的大鼠脊髓Akt蛋白阳性表达细胞均明显高于相同时间点的损伤组，显微图像结果分析也证明，rHuEPO治疗组大鼠脊髓Akt蛋白阳性表达细胞平均光密度值明显高于相同时间点的损伤组大鼠。 2、Western blot结果 从电泳条带上可以看出，脊髓损伤后Akt阳性表达迅速降低，脊髓损伤后24h，Akt表达降至最低，3d时开始上升，与假手术组相比显著降低(P＜0.05);rHuEPO治疗组6h、12h、24h、72h时间点的大鼠脊髓Akt蛋白阳性表达均明显高于损伤组(P＜0.05)。 （二）p-Akt检测结果 1、免疫组织化学结果 在假手术组的脊髓组织中可发现大量的p-Akt蛋白阳性表达细胞，脊髓损伤后Akt阳性表达细胞数迅速降低，在脊髓损伤后12h时，脊髓损伤部位的p-Akt蛋白阳性表达细胞数最低，24h时略有回升，3d时p-Akt蛋白阳性表达细胞数最高，与假手术组相比阳性细胞数均显著降低(P＜0.05);rHuEPO治疗组6h、12h、24h、72h时间点的大鼠脊髓p-Akt蛋白阳性表达细胞均明显高于相同时间点的损伤组大鼠，显微图像结果分析证明，rHuEPO治疗组大鼠脊髓p-Akt蛋白阳性表达细胞平均光密度值明显高于损伤组（P＜0.05)。 2、Western blot结果 从电泳条带上可以看出，脊髓损伤后，脊髓损伤部位的p-Akt的光密度值迅速降低，脊髓损伤后12h的光密度值最低，24h时开始回升，3d时表达最高，与假手术组相比显著降低（P＜0.05);rHuEPO治疗组6h、12h、24h、72h时间点的大鼠脊髓p-Akt蛋白阳性表达均明显高于相同时间点的损伤组大鼠（P＜0.05）。 讨论： 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种调节红细胞生成的激素，是促进哺乳动物红系祖细胞增殖和分化的主要细胞因子。研究发现，EPO通过使线粒体膜去极化能够降低caspase-8、caspase-1和caspase-3的活性，调节细胞凋亡，还有研究报道，EPO能够调节细胞外信号激酶与蛋白激酶B，抑制caspase-8、caspase-3和caspase-1激活引起的线粒体细胞色素C释放，继而发挥保护神经细胞凋亡的作用。 研究证实，脊髓继发性损伤广泛存在着细胞凋亡现象。丝/苏氨酸激酶(Akt)又名为蛋白激酶B(PKB)，是生物信号传递途径中的重要因子，并与磷脂酰肌醇-3-羟基激酶(P13K)构成重要的P13K/Akt信号传导通路，可以抑制细胞凋亡，促进细胞存活，但是其是否参与了细胞生成素调节脊髓损伤的信号通路尚不清楚。 在本实验中，从免疫组化结果可以看出，假手术组的脊髓组织中可发现大量的Akt、p-Akt蛋白阳性表达细胞，而在脊髓损伤后，Akt与p-Akt蛋白阳性表达细胞数迅速降低;显微图像分析结果发现，rHuEPO治疗组相同时间点的大鼠脊髓Akt、p-Akt蛋白平均光密度值均明显高于相同时间点的损伤组大鼠。Western blot也得到了相同的结果，提示上调损伤部位Akt与p-Akt蛋白的表达可能是EPO对脊髓损伤发挥治疗作用的机制之一。 结论： EPO能上调哮喘SCI大鼠损伤部位Akt和p-Akt的表达，提示EPO可能通过调节Akt和p-Akt的表达对SCI提供神经保护作用。