新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副黏病毒科(Paramyxoviridaae),禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的一个成员,为具有囊膜且含单股负链不分节段RNA基因组的病毒,其基因组大小约为15.1kb,至少编码6种病毒蛋白。其中,M蛋白是含量最为丰富且高度保守的非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成病毒内膜与核衣壳蛋白连接的支架。同其它副黏病毒M蛋白一样,NDV M蛋白也具有细胞核-细胞质穿梭特性。在病毒感染早期,M蛋白主要聚集在细胞核和核仁中,并且在整个感染过程中持续存在于核仁中,其主要功能是抑制宿主细胞基因的转录和翻译,并确保病毒基因组在细胞质中有充足的时间进行复制和转录;而在感染后期,M蛋白进入细胞质,在细胞膜内侧能够通过与糖蛋白的胞质区、病毒核衣壳蛋白以及宿主细胞膜发生相互作用,以协助子代病毒粒子进行装配和释放。因此,M蛋白是一种多功能病毒结构蛋白,在病毒复制的过程中,尤其是在病毒的组装和出芽释放阶段发挥着核心的作用。根据实验室的前期工作,已经确定了M蛋白对新城疫病毒的复制及致病性存在重要的影响。然而目前为止,对M蛋白在NDV复制过程中的作用还有诸多未知的地方。本研究旨在探索M蛋白功能性氨基酸位点突变以及M蛋白与宿主细胞蛋白相互作用影响病毒复制的分子机制为研究目的,为进一步阐明M蛋白在NDV复制中的作用奠定基础。1.鸽副粘病毒1型M蛋白R36Q突变致弱病毒毒力及复制能力鸽副粘病毒1型(PPMV-1)是一种能够特异性的感染宿主鸽子的病原体,通常被认为是禽副粘病毒1型(APMV-1)在鸽子上的适应性变种。有研究报道PPMV-1的这种适应性变化与病毒基因及蛋白的变化有关,但是到目前为止,这种变化与病毒的生物学特性的关系仍未见报道。M蛋白通常被认为是仅次于F和HN蛋白的毒力因子,而M蛋白在病毒感染的早期过程中发挥着重要作用。有报道M蛋白对于PPMV-1的遗传进化及宿主适应性可能有重要作用。本研究首先对145株新城疫毒株(39株PPMV-1,106株APMV-1)进行了氨基酸序列比对分析,发现了 7个特异性氨基酸位点分别位于M,F,HN及L蛋白上,其中R36是位于M蛋白上的特异性氨基酸位点,同时,我们发现R36位点是M蛋白上的正向选择位点;随后我们以PPMV-1 Js/07/04/Pi(071204)株全长cDNA克隆质粒pNDV/071204为骨架构建了 M蛋白R36Q突变的重组病毒r071204-M.R36Q,为了进行反向比较,同时构建了以表达绿色荧光蛋白的NDV ZJ1株全长cDNA克隆质粒pNDV/ZJ1GFP为骨架构建了 M蛋白Q36R突变的重组病毒rZJ1GFP-M.Q36R。对两株重组病毒及其母本病毒进行生物学特性测定,结果发现,R36Q突变能够致弱r071204在细胞和鸡胚上的毒力并降低病毒复制能力,而Q36R突变对于rZJ1GFP母本病毒的各项生物学特性的影响没有显著差异。另外,鸽子攻毒实验结果显示,R36Q突变使得r071204-M.R36Q重组病毒在排毒时间及排毒量上都要显著低于母本病毒r071204。以上结果说明PPMV-1 M蛋白的R36可能是病毒宿主适应性的一个关键性氨基酸位点,对PPMV-1的复制能力、致病性及传播具有至关重要的作用。2.新城疫病毒M蛋白G275A和P276A联合突变影响病毒的复制和出芽据报道,M蛋白在病毒感染后期在细胞膜内侧进行病毒粒子的组装和出芽依赖于M蛋白C-端由2个α-螺旋包裹2个反向平行的β-折叠形成的特异性折叠结构与宿主细胞膜结合,后续研究推测,NDV M蛋白的275位G与邻近的276位P形成的GP组合对M蛋白形成正确的β-折叠极为重要。本研究中,我们首先对过去的研究结果进行了验证,通过将NDV M蛋白序列与其他副黏病毒M蛋白序列进行氨基酸比对,并结合三维结构模拟分析,我们证实NDV M蛋白C-端的LGP序列能够发挥类似双重氨基酸G的作用,当GP突变为AA时,M蛋白的折叠发生了角度的变化,影响了 M蛋白功能的发挥,继而,我们拯救了两株突变重组病毒,分别是rZJ1GFP-M.LGP/GGL,rZJ1GFP-M.GP/AA,生物学特性测定的结果显示,GP/AA突变重组病毒显著降低了病毒在鸡胚及细胞上的复制能力和致病性,动物致病性实验也说明GP/AA突变造成了病毒的致弱,以上结果均说明GP序列对于病毒复制及致病性是至关重要的,此外,对重组病毒在细胞上的出芽能力进行测定,结果表明GP/AA突变后能够大幅损伤病毒出芽能力,间接说明GP/AA突变导致的结构变化影响了病毒粒子的出芽,这也解释了为何病毒的复制能力下降。我们的实验结果说明M蛋白上的GP序列在NDV的生活周期中发挥了极为重要的作用。然而,仍需进一步通过结构蛋白质组学来阐释GP影响出芽的具体机制。3.新城疫病毒M蛋白羧基端功能结构域影响病毒的早期复制本研究对NDV ZJ1株M蛋白C-端影响二聚体矩阵形成的氨基酸进行突变,并观察点突变对M蛋白亚细胞定位的影响,然后通过反向遗传学技术拯救点突变病毒,进一步研究点突变对病毒复制和致病性的影响。结果显示,M蛋白C-端D255、E258、R262、R263氨基酸单点突变以及255/258(DE)双点突变后,不影响M蛋白细胞核和核仁定位,但是262/263(RR)、255/263、258/262双突变后导致M蛋白由细胞核及核仁定位变为细胞质定位,随后我们以表达绿色荧光蛋白的NDVZJ1株全长cDNA克隆质粒pNDV/ZJ1GFP为骨架构建了 M蛋白相应的单点突变及双点突变全长质粒pNDV/ZJ1GFP-Mwt,利用反向遗传学技术,成功拯救出8株重组病毒。生物学特性测定结果显示,单点及双点突变均不能导致病毒的生物学特性发生改变。然而,255/258(DE)、262/263(RR)、255/263、258/262双突变病毒在DF1细胞中早期的增殖能力、CPE形成能力及表达GFP能力均显著下降,说明双突变仅仅降低了病毒的早期复制能力和致病性。我们的研究结果表明影响M蛋白二聚体矩阵形成的氨基酸位点能够影响M蛋白的细胞核定位,并且降低病毒的早期复制能力和致病性。4.新城疫病毒M蛋白与细胞膜联蛋白A6相互作用影响病毒的复制由于病毒编码蛋白能力的限制,病毒不能编码出复制所需的所有蛋白,因此,病毒往往需要利用宿主细胞蛋白或细胞结构组分来完成病毒的复制过程。本研究中我们首先通过激光共聚焦对M蛋白与宿主膜联蛋白A6(ANXA6)蛋白在细胞中的定位情况进行了观察,结果显示M蛋白与ANXA6蛋白在细胞质中存在着共定位。此后,通过免疫共沉淀技术和GST Pull-down实验,我们进一步验证了 M蛋白与ANXA6蛋白能够发生互作。通过His Pull-down方法对M蛋白与ANXA6相互作用结构域进一步鉴定发现M蛋白aa250-280是M蛋白与ANXA6蛋白结合的区域。为了探索ANXA6蛋白与M蛋白互作对病毒复制的影响,我们设计了 RNA干扰实验以及宿主细胞内过表达ANXA6实验,结果表明,抑制ANXA6蛋白表达能够促进病毒感染细胞病变的产生并提高了病毒的复制效率,说明ANXA6的存在抑制了病毒的复制;另一方面,细胞内过表达ANXA6蛋白显著减轻了 NDV感染细胞引起的CPE并抑制了病毒的增殖,说明在细胞内过表达ANXA6明显降低了病毒的复制。以上结果表明,宿主ANXA6蛋白能够负调节NDV的复制过程。