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鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)为革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,不运动,是引起鸭败血症的病原,同时也可以感染家鸭、火鸡及多种其他鸟类。呈急性或慢性经过,主要病理特征为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。由于本病的高死亡率、致鸭体重减轻和高淘汰率,使其成为养鸭业经济损失最严重的疾病之一。其高致病率和高死亡率被认为是集约化肉鸭养殖的一个主要问题。因此,建立RA的快速检测和基因分型方法具有重要的意义。
本试验从浙江省温州地区某鸭场送检疑似鸭疫里氏杆菌病死鸭的脑、心包液、脾及肝中分离到WZ1和WZ2两株细菌,这两株细菌进行组织病理学观察、菌落形态观察、染色镜检、生化鉴定及动物回归实验,证实分离的两株细菌为鸭疫里氏杆菌。两株细菌对新霉素、头孢孟多、氟嗪酸及壮观霉素等抗生素敏感。
本研究根据GenBank中26株鸭疫里氏杆菌的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功建立了鸭疫里氏杆菌的快速PCR检测方法并对18株RA菌株进行扩增,结果所有的鸭疫里氏杆菌均能扩增出767bp的特异性目的条带,而鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌和鸭源沙门氏菌均为阴性。PCR产物经测序鉴定证实为RA。最低检出基因组DNA为1Pg。该方法能从病料组织培养4小时的混合物中快速、准确地检测到RA,提示该方法可用于RA的快速诊断和流行病学调查。
建立了一种针对RA的Rep-PCR基因分型方法,以提纯的RA基因组或者全菌体基因组为模板,进行Rep-PCR扩增。根据扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱,将18株RA区分为8个不同的基因型,不同血清型的RA图谱有明显差异,相同血清型RA的图谱也存在差异。RA基因组中重复的基因外回文结构可用于区别相同血清型的不同分离株。提示Rep-PCR作为一种实用的基因分型方法,在流行病学研究中可对RA分离株进行基因分型。
总之,本研究所建立的针对RA的PCR检测方法及Rep-PCR分子分型方法,为在养鸭业中预防控制鸭疫里氏杆菌病提供了一种有力工具。