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直至目前结核病仍是全球最严重的传染病之一，全世界约有1/3的人口都感染有结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis），据世界卫生组织(WHO)统计数据显示2011年有140万人死于结核病。结核分枝杆菌的耐药性和持留性是结核病治疗中需要攻克的两大难题。一部分结核分枝杆菌被宿主巨噬细胞吞噬后会进入持留状态，不仅可以躲避胞外抗结核药物的攻击，同时还利用乙醛酸循环提供能量以维持生存[1]。异柠檬酸裂解酶（isocitratelyase，Icl）是乙醛酸循环中的一个关键限速酶[1]，同时缺失M.tuberculosis的两个icl基因后，胞内细菌的复制被完全破坏且肺组织能快速清除残留细菌，用异柠檬酸裂解酶抑制剂3-硝基丙酸盐（3-nitropropionate，3-NP）抑制Icl1与Icl2的活性，结核分枝杆菌在巨噬细胞中和以脂肪酸作为唯一碳源的培养基上的生长被阻碍[2]。IclR通过调控Icl的表达来调节乙醛酸循环从而控制细菌对碳源的利用。因此，分析IclR的转录调控可以进一步寻找结核分枝杆菌持留性调控网络中的相关基因。
根据lclR的保守结构域在M.tuberculosisH37Rv基因组中寻找到三个IclR基因，分别为Rv1773c，Rv1719和Rv2989。M.tuberculosis经卷曲霉素处理后，3个IclR仅Rv2989表达量降低[3]。基因芯片分析发现M.tuberculosis饥饿处理后Rv2989的表达量下调[4]，与碳代谢相关。本实验选取Rv2989的启动子为研究对象，为了鉴定Rv2989的启动子活性区域，首先根据GenBank数据库中M.tuberculosisH37RvRv2989上游核苷酸序列，利用PrimerPremier5设计引物，以提取的M.tuberculosisH37Rv基因组作为模板，PCR扩增Rv2989基因起始密码子上游DNA片段。经双酶切处理后与分枝杆菌启动子探针载体pEJ414连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性重组菌后送公司测序验证。提取重组质粒电转耻垢分枝杆菌感受态细胞，挑取单菌落提取质粒进行PCR鉴定阳性克隆。以结核分枝杆菌rel基因启动子作为阳性，空载pEJ414作为阴性，检测克隆片段启动子活性。将重组菌滴加到含有X-gal的7H10平板上避光培养观察菌落是否变蓝以定性检测启动子活性。以ONPG为底物，通过检测在420nm波长下分解产物ONG的光密度值计算β-半乳糖苷酶活力以定量检测启动子活性。通过定性和定量结果来判断Rv2989的最小启动子区域。之后扩增最小启动子上游片段构建pEJ414重组质粒测定其是否具有启动子活性或低于整个片段的活性来验证启动子区域。提取M.tuberculosisH37Rv的总RNA，利用Rv2989特异引物将包含转录起始位点的mRNA反转录为cDNA，在其3端人工加上polyA尾巴后，以dT和特异引物进行半巢氏PCR扩增cDNA片段，通过胶回收纯化后送公司测序即可获得Rv2989基因的转录起始位点。最后，利用DNA-pulldown技术寻找Rv2989启动子的结合蛋白。
通过本研究检测到Rv2989由多个弱启动子起始转录，在起始密码子上游100bp、101-200bp和201-300bp区域内均有启动子活性。上游300bp的范围是Rv2989的最小启动子区域，且301-400bp区域可能有转录因子结合位点或增强子结构加强Rv2989启动子的活性。5-RACE技术扩增出的含有Rv2989转录起始位点的DNA片段恰好也是3个，片段的长度也与以上的3个启动子区域相符。