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目的:在全世界范围内,肺癌的发病率和死亡率都名列前茅。近年来,根据患者自身情况,如肿瘤病理类型、肿瘤大小、侵袭范围等制定个性化的治疗方案以及包含分子靶向治疗在内的综合治疗备受推崇。虽然治疗手段取得了较明显的改善,但肺癌的总体预后仍然不佳,5年平均生存率仅为15%。肿瘤组织中血管的高密度生成预示着肿瘤的恶性生长,侵袭转移以及复发趋势。血管新生的过程需要多种诱发因子,其中HIF、VEGF、MMP-2、MMP-9等起着尤为关键作用。肿瘤的发生通常伴随着细胞缺氧微环境的存在。而在细胞处于低氧微环境时细胞中的缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）转录活性增强,提高肿瘤细胞对缺氧环境的适应能力,还能够促进细胞增殖、侵袭,并增强肿瘤细胞的放化疗抵抗性。在缺氧环境下,肿瘤组织内HIF-1α的表达水平升高引起其下游基因VEGF等的上调,最终导致肿瘤内血管增生活跃,更进一步为肿瘤细胞输送养分,进而促进肿瘤生长。因此,抗肿瘤内的血管生成对于肿瘤的控制具有极其重要的作用。MicroRNAs在真核细胞中广泛存在,是一种非编码小分子RNA序列,参与包括细胞增殖、周期、凋亡等多种细胞生物学功能的调节,在人体发育、疾病发生过程中均发挥着重要的作用。据报道,多数miRNAs所在的基因组区域与肿瘤有关,因此miRNAs在肿瘤的发生及演进中可能发挥着极其重要的作用。近年来的研究发现,miR-214在多种肿瘤中都存在表达失调,并且有可能成为诊断肿瘤的新标记物或治疗肿瘤的新靶点,但其在肺癌中表达和作用尚不清楚,并且,在已有的报道中尚未发现探讨miR-214与肿瘤缺氧诱导因子HIF以及血管生成之间的关系。生长抑制因子蛋白家族（inhibitor of growth family,ING）是目前一类重要的抑癌因子,可抑制细胞中NF-κB信号通路活性,激活p53并调控通路相关因子的表达,进而抑制肿瘤的恶性发展,并抑制肿瘤细胞对药物的抵抗性。目前国内外学者多集中于ING4的表达下降与肿瘤发生间的关系,然而对于ING4对血管内皮细胞生物学功能的影响以及miR-214对它的调控作用的研究尚未见报道。本研究通过ING4质粒及siRNA转染明确ING4对血管内皮细胞的生长及生物学功能的影响及其对HIF-1ɑ的调节作用;通过microRNA模拟物及抑制物转染、Real time PCR、western blot等方法,探讨miR-214在肺癌细胞中的生物学作用,并且进一步分析上述作用是否是通过抑制ING4激活HIF信号通路而实现的,进而揭示miR-214与ING4、ING4与血管生成之间的关系,明确miR-214能否通过调节ING4的表达,调节肿瘤的血管生成并影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。方法:1、人脐静脉内皮细胞株HUVECs传代培养,应用CoCl2处理HUVECs模拟缺氧状态。2、肺腺癌细胞株A549及H1299传代培养。3、构建ING4过表达质粒及siRNA转染至A549,H1299细胞及HUVECs。4、构建miR-214模拟物及抑制物转染至A549及H1299细胞株。5、MTT实验及集落形成实验分析细胞的增殖能力变化。6、Transwell实验检测细胞迁移能力。7、划痕实验分析细胞侵袭能力变化。8、荧光素酶报告基因实验分析miR-214对ING4表达的调控作用。9、Real time PCR及Western blot实验检测ING4、VEGF、MMP-2、MMP-9、HIF-1α及其靶基因AK3的mRNA及蛋白表达水平。结果:1、ING4抑制HUVECs细胞的增殖、迁移,并下调VEGF、MMP-2、MMP-9的表达HUVECs细胞转染ING4质粒后,细胞的增殖比例较对照组相明显降低,而通过siRNA干扰HUVECs细胞中ING4后,细胞的增殖比例较对照组明显升高。CoCl2处理细胞12h后,结果与常氧状态一致,但是促进与抑制作用均较常氧状态减弱。Transwell迁移实验结果显示:常氧或缺氧状态下,转染ING4质粒上调其表达水平可抑制细胞的迁移能力,而通过siRNA干扰ING4表达则提升细胞的迁移能力。Real time PCR及Western blot实验结果显示:过表达ING4后,HUVECs细胞中血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平降低,而干扰ING4后,血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平升高。2、ING4对HIF-1α的调节作用Real time PCR及Western blot实验结果显示:HUVECs经CoCl2处理12h后,HIF-1α及其靶基因AK3的mRNA及蛋白表达水平明显升高,而转染ING4质粒后表达水平均降低,转染ING4 siRNA后表达升高。3、miR-214对肺癌A549及H1299细胞增殖、迁移、侵袭及血管生成相关因子的影响集落形成实验结果显示:A549及H1299细胞中转染miR-214 mimics上调miR-214表达水平后,细胞克隆的数目与转染mimic control的对照组相比明显增加。Transwell实验结果显示:转染miR-214 mimics后,细胞穿过小室的细胞数量比对照组明显增多。划痕实验结果显示:转染miR-214 mimics上调miR-214表达水平后,细胞划痕修复的速度明显加快。Real time PCR及Western blot实验结果显示:转染miR-214 mimics后,血管形成相关因子VEGF、MMP-2、HIF-1α及AK3的mRNA及蛋白表达水平上调。转染miR-214 inhibitor则表现出相反作用。4、miR-214对ING4的调控作用Real time PCR及Western blot实验结果显示:A549及H1299细胞转染miR-214mimics能够下调ING4 mRNA及蛋白的表达;转染miR-214 inhibitor能够上调ING4mRNA及蛋白的表达。转染miR-620及对照组miRNA对ING4 mRNA的表达没有影响。荧光素酶报告基因实验结果显示共转染miR-214 mimic与野生型ING4质粒后荧光素酶活性降低,而突变型ING4质粒共转染组荧光素酶活性无明显变化。并且,转染miR-214 mimics能够上调MMP-2、VEGF的表达并增强HIF-1α的活性,而共转染miR-214 mimics与ING4质粒能够逆转上述作用,共转染miR-214 mimics与ING4 siRNA能够增强上述作用。转染miR-214 inhibitor能够下调MMP-2、VEGF的表达并抑制HIF-1α的活性,而共转染miR-214 inhibitor与ING4siRNA能够逆转上述作用。结论:1、ING4抑制血管内皮细胞的增殖及迁移,抑制细胞中血管形成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9的表达,最终抑制新血管形成。其可能的分子生物学机制为在缺氧环境下,ING4下调HIF-1α的表达并抑制其下游靶基因AK3的表达。2、miR-214能够促进肺癌细胞的增殖、侵袭及迁移,并能够上调血管形成相关因子VEGF、MMP-2、HIF-1α及其靶基因AK3的表达,因此miR-214在肺癌细胞中起到癌基因的作用。3、miR-214是ING4的一个调控因子,miR-214能够通过抑制ING4的表达激活HIF-1α,进而上调血管形成相关因子VEGF、MMP-2的表达水平。因此miR-214可能通过下调ING4激活HIF信号通路进而促进肺癌细胞的恶性生物学行为。