胶质瘤(Glioma)是中枢神经系统最常见的肿瘤,约占颅内肿瘤的44.69%,居颅内肿瘤发病率的第一位。不可否认,对于胶质瘤发病因素及发病机理的认识有助于胶质瘤的有效预防以及寻找最新的靶向治疗措施。目前,胶质瘤的治疗效果依然很差,一般患者的5年生存率只有5%左右,国际上仍无良好的治疗办法,导致胶质瘤预后不佳的根本原因在于它一系列的恶性生物学行为,包括肿瘤细胞的过度增殖、对周围脑组织的侵袭、化疗药物耐药等,尤其是肿瘤细胞的过度增殖,是导致胶质瘤术后快速复发的重要因素。目前的治疗理念是先以显微镜下最大限度的肿瘤手术切除为主,然后联合放射治疗及化疗作为辅助治疗的综合治疗,但是由于胶质瘤生长部位的特殊性以及其无节制生长的临床特点,治疗效果并不理想,肿瘤细胞的这种快速增殖和早期向周围正常脑组织浸润转移,使其成为预后最差的肿瘤。自二十世纪以来,随着分子医学研究和肿瘤基因学的发展不断的深入,人们对脑胶质瘤的发病机制亦取得了一些新的认识,但是仍未找到一个行之有效、具体的防治办法和治疗措施。寻找一种新的、有效的、具有较高特异度的分子基因标志物,能够对脑胶质瘤患者进行早期的预后判断就变得尤为重要。如何有效的抑制胶质瘤细胞的过度增殖,从而延长患者的生存期并改善其生存质量,也是目前胶质瘤治疗领域的一大难题。因此,对胶质瘤细胞过度增殖的分子作用机制进行研究,并针对其进行有效的干扰和抑制,探讨胶质瘤的发病机制、寻找有效的治疗靶点已成为胶质瘤基因治疗攻关的重点。近年来,为了探索胶质瘤的发病原因及其易感性,胶质瘤相关基因方面的研究逐渐展开,目前成为热点。其特定的基因组及组织学特点导致胶质瘤成为复杂多因素疾病。多个研究表明,癌基因、抑癌基因和相关的调控基因均参与其中。高尔基体磷蛋白3(GOLPH3:Golgi phosphoprotein 3)被认为是外壳蛋白(coat proteins)的一种,不同于其他的细胞膜癌基因蛋白,GOLPH3大部分位于Trans-Golgi Network (TGN),由于这个原因,它被定义为第一个高尔基体的癌基因。由5p13染色体(在一些实体肿瘤中经常扩增的染色体区域)上的基因进行编码,通过结合基因组学、临床病理及功能分析,人类GOLPH3被确认为是一种新的癌蛋白。2009年ScottKL等报道,GOLPH3可能是癌症发生的一个关键因素,在多种实体恶性肿瘤中存在过量表达,并参与囊泡运输、细胞分裂及蛋白质糖基化等多个肿瘤形成过程,表明GOLPH3可作为一种癌蛋白发挥作用,并推测GOLPH3在肿瘤中的作用与nTOR信号通路有关,肿瘤细胞对雷帕霉素敏感性的初步研究显示,过表达GOLPH3可能增加AKT的活化,减少对雷帕霉素的敏感,促进细胞增殖。2009年Dippold等报道GOLPH3与高尔基体保持正常形态有关并有利于芽泡的生成。Wood等报道GOLPH3可与磷脂酰肌醇-4-磷酸(Ptdlns(4)P)结合,通过对高尔基体结构和功能的调节来控制细胞内囊泡的分泌及运输,由此说明GOLPH3在高尔基体分泌泡形成和运输过程中起着重要的作用。目前的研究表明GOLPH3可参与细胞内蛋白转运、受体循环及糖基化等多种过程,作为一种癌蛋白发挥作用,这些过程与肿瘤的形成有潜在的联系。自从第一次被证明是一个癌基因以来,GOLPH3已被大量的研究报道,在许多肿瘤中,GOLPH3的上调和患者的不良预后有关,可能通过多条信号通路促进肿瘤细胞的增殖,如mTOR/AKT通路或Writ通路等,因此GOLPH3可能是靶向药物治疗的有效基因靶点。NDRGl(N-myc downstream regulated gene 1)于1997年第一次被分离,在人体正常组织及肿瘤中均存在表达,且同时也被发现参与了胚胎发生发育、细胞生长分化、脂质合成、髓鞘形成、应激反应和免疫功能等多个过程。目前发现NDRG1的表达受多种因素的调节,包括N-myc基因,组蛋白乙酰化,缺氧,细胞内铁和钙的水平等。多项研究已证实,NDRG1在细胞分化过程中可被诱导产生,其表达上调会引起粒单细胞系增殖停止,表明NDRG1可在终末分化中起到作用。有学者发现,正常上皮细胞分化过程中其mRNA上调,而在肿瘤细胞中表达则下调,提示其可能与细胞的分化和增殖有关。在肾脏中,PKD2通过EGR1转录因子而使NDRG1过表达,来起到促进增殖的作用。此外,NDRG1还和微管及中心体、纺锤体酯化以及多种P53相关基因息息相关。下调NDRG1和α-微管蛋白乙酰化减少有关,微管蛋白的减少可影响纺锤丝的形成,并进一步影响细胞分裂。此项研究证实NDRG1在细胞有丝分裂中存在保真性和抑制基因不稳定性的作用,减少NDRG1的表达会使基因得不稳定性增加,并可能进一步导致肿瘤。近十余年来,研究发现,NDRG1在胰腺癌、结肠癌等多种肿瘤中低表达,而在肝癌、子宫内膜癌、胆管癌中却发现,NDRG1的蛋白表达较正常组织明显增高,说明对NDRG1的研究目前仍不一致。然而在胶质瘤中,NDRG1的表达如何,且又发挥什么样的生物学行为,目前国内外研究较少,仍需要进一步探讨。有学者发现,GOLPH3和NDRG1均和高尔基体的囊泡运输有关,GOLPH3定位在高尔基体可以促进囊泡的分泌,而NDRG1定位在高尔基体周围的胞浆,NDRG1也是TGN网络系统的一部分,可以促进囊泡内容物回收,帮助机体完成整个囊泡运输。磷脂酰肌醇-4-磷酸(PtdIns(4)P)是高尔基体结构和功能的主要调节因素,Wood等报道GOLPH3可与PtdIns(4)P结合,并控制细胞内囊泡的分泌,而NDRG1也能并口PtdIns(4)P相结合,通过反面高尔基体的ARF1参与细胞内的囊泡运输。另外,GOLPH3和NDRG1均和PI3K/Akt/mTOR通路、Wnt通路及细胞内细胞骨架、纺锤丝的形成有关,但GOLPH3和NDRG1的具体关系仍需进一步探讨。为此,结合目前研究现状,我们首先联合检测了GOLPH3和NDRG1在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达情况,分析了其与不同胶质瘤病理级别的关系,并在胶质瘤细胞中研究了GOLPH3和NDRG1对胶质瘤细胞凋亡、增殖的影响,且对其潜在的关系和机制进行了探讨。第一部分GOLPH3、NDRG1在胶质瘤中的表达及相关性的研究目的本实验研究GOLPH3、NDRG1分别在正常脑组织和人脑胶质瘤组织不同病理级别中的表达,并对其表达情况与胶质瘤病理级别的关系进行研究。方法本实验分为正常脑组织组、胶质瘤Ⅱ级组、Ⅲ级组和Ⅳ级组,正常脑组织来自于脑外伤患者需要行颅内减压手术而取得的非坏死的正常脑组织标本。应用Real-time RT-PCR法和Western Blot法检测34例人脑胶质瘤标本和9例正常脑组织中的GOLPH3和NDRG1的mRNA和蛋白水平,并进行统计学分析；应用免疫组织化学方法检测9例正常脑组织标本和76例人脑胶质瘤组织标本中的GOLPH3和NDRG1表达情况,并分析两种基因表达的相关性。结果1.在人脑胶质瘤组织和正常脑组织中,GOLPH3和NDRG1在mRNA水平和蛋白水平均有表达。在人脑胶质瘤中,GOLPH3的mRNA和蛋白的表达水平均高于正常脑组织,且与正常脑组织中的表达差异有统计学意义(P＜<0.05),并随着胶质瘤的病理级别的增高而增加。而NDRG1的mRNA和蛋白表达量在正常脑组织中表达较低,在人脑胶质瘤Ⅱ级组中最高,差异有统计学意义(P<0.01),在胶质瘤组织中,随着病理级别的升高,NDRG1的mRNA和蛋白表达水平逐渐降低。NDRG1的mRNA和蛋白在正常脑组织组和Ⅲ级组、Ⅳ级组中的表达无明显统计学意义(P>0.05)。在胶质瘤组织中,GOLPH3和NDRG1在RNA水平和蛋白水平的表达趋势相反。2. GOLPH3的免疫组化结果显示,GOLPH3的阳性表达主要位于细胞内细胞核旁,相当于高尔基体位置,呈粗大颗粒状,部分染色为细小颗粒状,着色弥散存在于细胞质中。GOLPH3在正常脑组织组和胶质瘤组中的阳性表达率分别为22.2%(2/9)、57.9%(44/76),两者比较(x=4.124,P<0.05);Ⅱ级组39.1%(9/23),Ⅲ级组54.2%(13/24), Ⅳ级组75.9%(20/29)。这说明GOLPH3蛋白表达阳性率在胶质瘤组织中高于正常脑组织,且随病理级别增高而升高。NDRG1的免疫组化结果显示,NDRG1的阳性表达主要位于细胞的细胞质,也有部分表达在细胞膜或细胞的连接部位。NDRG1在正常脑组织组和胶质瘤组中的阳性表达率分别为44.4%(4/9)、46.1%(35/76),两者比较(x=0.008,P>0.05)；Ⅱ级组60.9%(14/23),Ⅲ级组,41.7%(10/24), Ⅳ级组20.6%(7/29)。在脑胶质瘤组织中,NDRG1蛋白表达阳性率随病理级别增高呈降低的趋势。NDRG1和GOLPH3的免疫组化阳性率情况和Western-Blot检测的蛋白表达趋势是一致的。结论 1、GOLPH3和NDRG1在正常脑组织和胶质瘤组织中均有表达。在胶质瘤组织中,GOLPH3的表达随着肿瘤组织病理级别的升高逐渐升高,而NDRGl的表达随着肿瘤组织病理级别的升高逐渐减低。2. GOLPH3和NDRGl在胶质瘤中的表达呈负相关。第二部分GOLPH3和NDRG1对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及相关机制的研究目的探讨GOLPH3和NDRG1对胶质瘤细胞凋亡、增殖的影响及两者之间的关系、可能机制,为胶质瘤治疗提供潜在的基因治疗分子靶点。方法 1.在胶质瘤细胞U251及U87中,用lipofectamine2000转染GOLPH3或NDRG1的siRNA,用Polyjet转染GOLPH3或NDRG1的过表达质粒。2.运用Western Blot检测其蛋白表达水平；流式细胞术检测GOLPH3siRNA,NDRG1 siRNA、GOLPH3过表达质粒及NDRG1过表达质粒对U87、U251细胞凋亡的影响；CCK-8法检测细胞增殖情况。结果 1.下调GOLPH3或过表达NDRG1后,胶质瘤U251、U87细胞的凋亡增多,增殖能力下降,过表达GOLPH3或下调NDRG1后,胶质瘤U251、U87细胞的凋亡减少,增殖能力升高。2.在胶质瘤U251细胞系中下调GOLPH3后,NDRG1、cleaved-caspase3的蛋白表达水平明显增加,过表达GOLPH3后,NDRG1、cleaved-caspase3的蛋白表达水平明显减少。3.在胶质瘤U251细胞系中下调NDRG1, GOLPH3的蛋白表达水平变化无统计学意义,cleaved-caspase3的蛋白表达水平减少。结论1.下调GOLPH3或过表达NDRG1促进细胞的凋亡,减少增殖,而过表达GOLPH3或下调NDRG1则减少细胞的凋亡,促进增殖。GOLPH3和NDRG1均和胶质瘤细胞的凋亡,增殖有关,有可能成为胶质瘤治疗的新靶点。2. GOLPH3可能位于NDRG1的上游,干扰GOLPH3可通过上调NDRG1并增加cleaved-caspase3的表达来促进胶质瘤细胞的凋亡。