宫颈癌(cervical cancer)是妇科肿瘤中发病率最高，死亡率占第二位的肿瘤。严重威胁着女性的健康。临床、流行病学和分子生物学的调查资料表明，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)与宫颈癌的发生密切相关，90％以上的宫颈癌患者组织中可检测到人乳头瘤病毒。　　生殖道感染的HPV可以引起宫颈上皮细胞内瘤样病变(cervical intraepithelialneoplasia，CIN)和宫颈癌。根据病毒与病变恶性程度的相关性，生殖道粘膜感染的HPV可以分为低危型HPV与高危型HPV。其中HPV-16和HPV-18是最常见的高危型HPV，在宫颈癌患者组织中检出率达到70％。高危型HPV的持续性感染与宫颈癌的发生发展密切相关，因为高危型HPV的E6，E7蛋白可通过对宿主干扰素的产生发挥直接或间接的抑制作用，下调宿主细胞粘附分子和MHC抗原分子的表达，影响抗原提呈细胞分泌共刺激分子以及通过调节宿主细胞的细胞因子分泌，促使Th细胞分泌Th2型细胞因子等方式使患者对HPV感染呈低免疫状态，病毒持续感染，最终出现临床症状。E6，E7蛋白都是多功能蛋白，可以与肿瘤细胞内多种细胞蛋白结合而发挥功能，其中最主要的是E6蛋白对抑瘤蛋白p53的降解，以及E7蛋白促使抑瘤蛋白pRB的磷酸化和泛素化降解，因此病毒E6，E7癌蛋白在肿瘤细胞内的持续性表达也是肿瘤细胞抗凋亡和老化，得以永生化的分子基础。E6，E7蛋白无需联合作用，各自都具有使人上皮细胞或角化细胞永生化的功能。　　高危型HPV对机体的免疫反应有多种逃避机制，虽然以HPV衣壳蛋白L1和L2为免疫原的预防性疫苗可以刺激机体产生中和抗体，阻止病毒进入细胞，防止感染，但是，治疗是以清除病毒感染细胞为目的，必须依赖细胞免疫。以E6，E7蛋白作为免疫原的治疗性疫苗并不能改善宫颈癌患者对HPV的低免疫状态，达不到预期效果。如何抑制E6，E7蛋白的功能成为宫颈癌基因治疗研究的热点。反义核酸和核酶都曾被用于对E6，E7基因的沉默研究，但近几年发展起来的siRNA(small interferingRNA，siRNA)则以其能对序列同源的靶mRNA发挥高效、特异的沉默作用而被广泛用于对HPV E6，E7基因的沉默研究。有多篇文献报道对HPV E6，E7蛋白表达进行siRNA干扰可以诱导HPV阳性的宫颈癌细胞株发生凋亡或老化。siRNA效能的发挥需要siRNA与靶mRNA结合，而靶mRNA核苷酸的变异以及二级结构都会影响siRNA的沉默效果。对宫颈癌组织中的HPV基因型的分子生物学检测发现HPV-16 E6的开放阅读框有多个核苷酸可以发生变异，从而影响siRNA的沉默效果，所以筛选HPV-16 E6siRNA要选择相对保守的区域，该区域还不能有不利于siRNA结合的二级结构。这就使选择HPV-16 E6 siRNA的作用靶变得比较困难。E6，E7蛋白发挥作用必须通过与细胞内蛋白结合，当这种结合受到抑制时则会影响E6，E7的功能。然而这些细胞内蛋白能否作为siRNA的作用靶，以及这些细胞内蛋白受到抑制后HPV阴性细胞的生理功能是否会受到影响，则未见报道。　　E6AP(E6-associated protein，E6AP)是与E6结合的一种细胞内蛋白。E6对p53功能的抑制是通过E6，E6AP及p53三者结合后，再由E6AP作为泛素连接酶对p53进行泛素化降解，减少p53的量而实现的。E6与E6AP结合还能活化端粒酶，抑制细胞老化。因此本文选择E6AP基因作为siRNA作用靶，研究抑制E6AP基因的表达对HPV阳性和阴性细胞p53含量及细胞凋亡的影响。　　应用siRNA进行基因治疗在体外和动物实验中也都取得很好的效果，而将siRNA用于临床治疗就必须选择合适的转移载体。重组杆状病毒以其对哺乳动物细胞无毒性，携带外源基因容量大，能转导的哺乳动物细胞种类多，转导效率高等特点，而成为临床基因治疗转移载体的一个新的研究热点。本文构建了重组杆状病毒作为siRNA转移载体，探讨了该重组杆状病毒用于肿瘤基因治疗的可能性。　　本论文包括如下二个部分:　　第一部分 siRNA干扰E6AP基因表达对宫颈癌细胞凋亡和老化的影响研究　　本研究探讨了siRNA干扰E6AP基因表达对宫颈癌细胞凋亡和老化的影响。分别构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)和E6AP的siRNA质粒载体pU6-eGFP和pU6-E6AP。该质粒载体应用RNA聚合酶Ⅲ U6启动子，转染细胞后在细胞内合成siRNA。将pU6-eGFP与eGFP表达质粒(pFast-Bac1-CMV-eGFP)共转染Hela细胞，通过检测细胞表达的荧光量来观察抑制效果。将pU6-E6AP分别转染HPV-18阳性的Hela细胞，HPV-16阳性的Caski细胞以及HPV阴性的C33A细胞，同时用pU6-eGFP分别转染上述细胞组作对照，通过光镜观察，Hoechst染色，FASC分析和Western blot等方法对细胞老化，细胞凋亡，细胞周期变化和细胞核内p53含量变化进行了研究。结果表明，pU6-E6AP能特异性诱导HPV阳性细胞株发生凋亡和老化;G1期细胞数量增多，S期细胞数量减少;细胞核内的p53的含量增加，而对HPV阴性的C33A细胞未见明显影响，提示pU6-E6AP诱导HPV阳性细胞株发生凋亡的原因与pU6-E6AP增加了细胞核内的p53的含量有关。　　本研究证明E6AP可以作为宫颈癌siRNA基因治疗的作用靶，从而为研究siRNA作为肿瘤基因治疗手段奠定了基础。　　第二部分 重组杆状病毒作为人类细胞RNA干扰转移载体的研究　　本研究探讨了重组杆状病毒作为人类细胞RNA干扰转移载体的可行性。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种序列特异性的转录后基因沉默机制。由21～23个核苷酸长的双链RNA对匹配的靶mRNA进行干扰。这种干扰作用高效、特异性强。本实验将RNA聚合酶Ⅲ U6启动子装入杆状病毒供体质粒的多克隆位点中，分别构建了针对增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和人类细胞蛋白E6AP基因表达的重组杆状病毒vAc-eGFP和vAc-E6AP。通过检测vAc-eGFP对荧光表达量的影响及vAc-E6AP对宫颈癌细胞系Hela和Caski细胞凋亡的影响，检测其转导siRNA的效率。结果显示:与阴性对照相组比，vAc-eGFP能降低荧光蛋白的表达，vAe-E6AP能诱导Hela和Caski细胞凋亡。结果表明可以利用重组杆状病毒作为RNA干扰的载体进行基因治疗。　　小结：　　本研究工作获得了如下主要结果:　　1.构建的RNA干扰质粒pU6-E6AP转染宫颈癌细胞，能诱导HPV阳性宫颈癌细胞凋亡或老化，而HPV阴性宫颈癌细胞未受明显影响。首次证实E6AP基因可以作为siRNA治疗的作用靶。　　2.成功地构建了重组杆状病毒作为siRNA的转移载体。　　3.本文首次证实重组杆状病毒能够作为肿瘤基因干扰治疗的siRNA转移载体。