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克罗恩病(Crohn’s disease, CD)是一种病因不明的炎性肠病(Inflammatory bowal disease, IBD),目前认为可能是具有遗传易感性的个体肠黏膜免疫系统的功能异常,对肠道菌群出现免疫耐受缺失,表现出过激的免疫反应导致肠道组织损伤。包括T细胞在内的固有层单核细胞(lamina propria mononuclear cells, LPMC)在肠道炎症的诱发和持续中起到关键性的作用,研究发现CD患者肠黏膜固有层T细胞表现出对凋亡的抵抗,导致固有层淋巴细胞数量显著增多,这是肠道炎症持续存在的重要原因。既往的研究认为CD是以Thl型免疫反应为主导作用,然而近期的研究表明一种新的T细胞亚型——Th17细胞在CD的肠道炎症中起到重要的作用。甚至有学者提出,以前认为的由于Thl型免疫反应引发的肠组织损伤其实是Th17型细胞免疫反应的结果。目前认为,可能是Thl型免疫反应和Th17型细胞免疫反应都参与了CD的肠道免疫反应。白介素-6(interleukin-6, IL-6)通过结合其可溶性受体(soluble IL-6 receptor, sIL-6R)形成跨膜信号(trans-signaling),IL-6跨膜信号激活信号转导子和转录激活子-3(signal transducer and activator of transcription-3, STAT3), STAT3能够有效的诱导固有层T细胞抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达,从而诱导T细胞对凋亡抵抗；同时STAT3还能够诱导维甲酸孤独受体-yt (retinoid orphan receptor y-T, RORyt)的表达,从而使IL-17 mRNA表达启动,进而促使T细胞向Th17细胞分化。综上,IL-6/STAT3信号通路能够诱导T细胞向Th17分化以及促使LPMC出现抵抗凋亡,因而在CD的肠道炎症的诱发和维持中起到重要的作用。IL-10基因敲除(IL-10gene deficient, IL-10-/-)小鼠在病理学及免疫学特征方面类似于人类的CD,是目前应用较为广泛的CD凋亡模型。IL-10-/-小鼠的结肠炎性浸润以大量淋巴细胞为特征。研究发现,3周龄的小鼠在肠黏膜固有层即出现大量的CD4+和CD8+T细胞,3个月大的IL-10-/-小鼠在结肠出现以CD4+和CD8+T细胞为特征的淋巴细胞浸润。另外研究还发现,与人类的CD病理机制相似,IL-10--/-小鼠也表现出Th1和Th17型免疫反应特征,Th17型免疫反应在IL-10-/-小鼠结肠炎症的发病机制中起到重要的作用。雷公藤多甙是雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook. F., TWHF)的提取物,临床研究发现,雷公藤多甙能够有效的诱导CD缓解及维持缓解。雷公藤甲素是雷公藤多甙的主要有效成分,具有广泛的抗炎和免疫抑制作用,研究发现,雷公藤甲素体外能够诱导树突状细胞(DC)等多种细胞的凋亡。研究表明雷公藤甲素能够抑制CD动物模型IL-100-/-小鼠肠黏膜Thl型炎症因子的表达和抑制核因子kappa B (nuclear factor kappa B, NF-kB)的活性,有效的缓解IL-10-/-小鼠结肠炎症。鉴于雷公藤甲素治疗CD机制的不明确性,以及CD病理机制研究的不断进展,尚需研究以进一步揭示雷公藤甲素对于CD的作用机制。本研究旨在探索雷公藤甲素对CD肠黏膜IL-6/STAT3信号通路的作用及其对肠黏膜免疫反应的调控作用：观察雷公藤甲素对IL-10-/-小鼠肠黏膜固有层T细胞凋亡的影响,雷公藤甲素对肠黏膜Th17型免疫反应的影响,重点观测体内对肠黏膜IL-6/STAT3信号通路的抑制作用；体外探索雷公甲素对离体培养的CD患者炎症肠组织的作用,重点探索雷公藤甲素对体外培养的CD患者肠黏膜IL-6/STAT3的影响,对培养组织的LPMC的凋亡、T细胞浸润和Th17免疫反应的作用,进一步验证动物实验的在体研究结论。全文分为二部分：第一部分雷公藤甲素对炎性肠病模型小鼠肠黏膜免疫系统IL-6/STAT3信号通路的影响目的：探讨雷公藤甲素治疗对IL-10-/-小鼠肠黏膜IL-6/STAT3信号通路的影响。方法：将IL-10"/-小鼠随机分为治疗组和对照组,分别予腹腔隔日注射雷公藤甲素和生理盐水,持续8周。每周进行一次疾病活动度(disease activity index, DAI)评分,于末次给药1周后,取小鼠结肠组织行H-E染色,行病理学检测及评分；ELISA检测结肠组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的表达；取各组小鼠结肠组织块离体培养24小时后,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养基上清中IL-6,sIL-6R的表达；提取黏膜蛋白,Wester blot检测STAT3和磷酸化信号转导子和转录激活子(phospho-signal transducer and activator of transcription-3, p-STAT3)的表达；分离肠黏膜固有层单核细胞(lamina propria mononuclear cells, LPMC),磁式分选CD4+T细胞,实时定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction, RT-PCR)检测gp-130、RORrtBcl-2、Bcl-xl和白介素-17 (interleukin-17,IL-17)的表达：流式细胞术检测T细胞的凋亡。结果：自给药后第6周开始,治疗组IL-10-/-小鼠疾病活动度(Disease activity index,DAI)较对照组显著下降；雷公藤甲素治疗8周后,病理学检测显示治疗组IL-10-/-小鼠肠道炎症程度较对照组显著减轻,病例评分显著下降(P<0.05)；MPO表达显著下降(P<0.05)；IL-6表达显著下降(P<0.05)；sIL-6R的表达无明显下降(P=0.451)；肠黏膜P-STAT3表达显著下降(P<0.05)；STAT3无明显改变(=0.171)；固有层T细胞gp130、RORγt、Bcl-2、Bcl-xl和IL-17mRNA的表达出现显著下降(P<0.05)；固有层T细胞凋亡显著增加。结论：雷公藤甲素能够有效减轻IL-10-/-小鼠的肠道炎症、抑制肠黏膜IL-6/STAT3信号通路、抑制Th17型免疫反应、促进固有层T细胞的凋亡。第二部分雷公藤甲素对CD患者肠黏膜免疫系统IL.6/STAT3信号通路的影响目的：雷公藤甲素对离体培养的CD患者炎症肠组织黏膜免疫系统IL.6/STAT3信号通路的影响。方法：以确诊的结肠型CD患者肠组织为研究对象(6例)。取手术切除的炎症肠组织,行体外培养,将肠组织分为两组,治疗组加入雷公藤甲素(20ng/ml),对照组以正常培养基培养。Real-time PCR检测肠黏膜IL-6 mRNA的表达；Western Blot检测肠黏膜STAT3、p-STAT3的表达；分离肠黏膜固有层单核细胞(LPMC), Real-time PCR检测LPMC的Bcl-2、Bcl-xl mRNA表达；Real-time PCR检测肠黏膜IL-17mRNA的表达；免疫荧光染色观测固有层T细胞数量的变化,流式细胞术检测LPMC的凋亡情况。结果：CD患者肠组织体外培养成功。雷公藤甲素体外能够降低CD患者肠组织的IL-6的表达(P<0.05)；雷公藤甲素能够显著降低p-STAT3的表达(P<0.05)；雷公藤甲素共培养能够降低CD患者肠组织的IL-17的表达(P<0.05)；雷公藤甲素能够显著降低固有层LPMC的Bcl-2、Bcl-xl表达(P<0.05),减少固有层T细胞浸润(P<0.05),促进固有层LPMC的凋亡。结论：雷公藤甲素体外共培养能够抑制CD患者肠黏膜免疫系统IL-6/STAT3信号通路；抑制Th17免疫反应,减轻固有层T细胞浸润,促进固有层LPMC凋亡。进一步验证了动物实验的体内研究所见,这可能是雷公藤甲素有效治疗CD的重要机制之一。