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为了建立发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)对园艺植物香石竹(Dianthus caryophyllus L.)的遗传转化体系以及探讨利用可自主生长毛状根的同源多倍体化来进行其多倍体种质创新的可能性,本文研究了发根农杆菌对多个香石竹品种的遗传转化、毛状根产生的影响因素、植株再生以及建立了香石竹毛状根秋水仙素倍性诱变的适宜条件及其同源多倍体的植株再生体系。其主要结果如下: 在供试的香石竹品种“红巴巴拉”、“彼特菲霞”、“弗尔特”、“红冠”、“玛伊考”和“绿夫人”中,发根农杆菌侵染其叶片外植体后,以“红巴巴拉”品种叶片外植体的生根率最高。当用发根农杆菌ATCC15834、R1000和K599菌液侵染叶片外植体后,以ATCC15834侵染“红巴巴拉”叶片外植体的生根率最高,达到47.6%。叶片外植体在采用MS培养基预培养和共培养后,再置于1/2MS+500mg/L头孢噻肟钠中培养后,其生根率最高,达到60.9%;而在共培养培养基中添加100μmol/LAS(乙酰丁香酮)则不能提高香石竹叶片外植体的生根率。与叶盘法相比,用发根农杆菌活化菌液浸泡香石竹嫩枝外植体时,其生根率比叶片外植体高;而采用菌液针刺接种植株幼茎后,其生根率不仅比叶盘法高,且相对于菌液浸泡法而言不会出现假阳性。 所有的香石竹毛状根都能在无外源激素培养基上自主生长;但采用rolB和rolC基因的PCR扩增实验结果显示,仅发根农杆菌K599侵染“红巴巴拉”外植体产生的部分毛状根能检测到rolB和rolC的扩增片段;而其余菌株感染后产生的可自主快速生长的毛状根均不能检测到rolB和rolC基因的扩增片段。 与MS培养基相比,香石竹毛状根在6,7-V培养基中的愈伤组织诱导效果更好,其愈伤组织诱导最适培养基为6,7-V+0.2mg/L2,4-D+0.8mg/L NAA。与“彼特菲霞”毛状根的愈伤组织相比,“红巴巴拉”毛状根诱导的愈伤组织更大且更疏松,其中,Ⅳ型毛状根诱导的愈伤组织比Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型毛状根诱导的愈伤组织生长更慢。毛状根愈伤组织只能在MS培养基上分化,并且只有Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型毛状根诱导的愈伤组织可以分化出不定芽,Ⅱ型毛状根愈伤组织最适分化培养基为MS+0.5mg/L6-BA;Ⅲ型毛状根愈伤组织最适分化培养基为MS+0.1mg/L6-BA;Ⅳ型毛状根愈伤组织最适分化培养基为MS+2mg/L NAA+0.8mg/L6-BA+0.2mg/L KT。毛状根愈伤组织分化产生的不定芽均能在MS培养基上增殖,在MS+0.1mg/L NAA培养基上生根。所得到的毛状根再生植株中,Ⅱ型和Ⅲ型毛状根再生植株的形态与非转化植株没有明显区别;但Ⅳ型毛状根再生植株与非转化植株相比,叶片更宽、叶尖皱缩、节间变短、生根能力更强。 香石竹Ⅳ型毛状根多倍体诱导的适宜条件是,0.1%的秋水仙素溶液处理毛状根48h,其多倍体诱导率最高,达到44%。毛状根多倍体愈伤组织在MS+2mg/LNAA+0.8mg/L6-BA+0.2mg/L KT中可分化出不定芽,发育成毛状根多倍体再生植株。多倍体植株根尖细胞的染色体数目观察结果表明,对照(非转化植株和二倍体毛状根再生植株)根尖染色体数目为2n=2x=30,而加倍的香石竹毛状根多倍体再生植株的根尖染色体数目为2n=4x=60,为同源四倍体。 本文结果表明,可自主快速生长的香石竹毛状根可用作利用秋水仙素进行人工多倍体诱变的起始材料。本实验结果也为今后利用发根农杆菌遗传转化和毛状根多倍体化来改善香石竹的观赏性状和进行其种质创新奠定了坚实的实验和技术基础。