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猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人兽共患病病原菌,目前共分为29个血清型,其中2型猪链球菌(S.suis serotype 2,SS2)的致病性最强,可导致猪和人的多种疾病和死亡,给养猪业和人类生命造成严重威胁,引起国内外学者的广泛关注。本文对2型猪链球菌05ZYH33表面蛋白糖苷水解酶SSU050630的功能进行了系统研究:通过SSU050630结构域分析、基因克隆、蛋白表达和纯化,获得了SsCBM、SsGH16、SsGH20和SsCBM+GH16四个结构域的蛋白,利用上述其中3种蛋白分别免疫日本大耳兔,制备了SsCBM、SsGH16和SsGH20结构域蛋白的多克隆抗体,抗体效价均达到了1:204800;应用信息肽GE9诱导片段转化和同源重组方法,构建了ssu050630基因缺失菌株,通过测定生长曲线和小鼠实验,对05ZYH33野生菌株(WT)和ssu050630Δ基因缺失株的生长特性和毒力进行了比较。结果显示,二者菌落形态、生长曲线及对小鼠致病力方面均无明显差别。为了验证SsGH20结构域蛋白具有β-1-2-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1-2-N-acetylglucosaminidase,NAG)活性,以NP-GlcNAc为底物进行研究,结果显示SsGH20的活力为371 U/mg蛋白、最适反应温度为50℃、最适pH为5.5、Km值为0.69,且仅WT菌株表面具有NAG活性,而ssu050630基因缺失株丧失NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株表面唯一具有NAG酶活性的蛋白,进一步采用含有复杂N-聚糖结构的转铁蛋白为底物,证明SsGH20结构域蛋白能够外切水解复杂N-聚糖中的β-1-2-N-乙酰氨基葡糖糖残基。SsCBM+GH16和SsGH16结构域蛋白的酶活性分析表明,SsGH16不能水解昆布多糖酶底物Laminarin、β-D-Glucan from barley、β-1,3-Glucan from Euglena gracilis,因此不具有昆布多糖酶活性。但是,SsCBM+GH16结构域蛋白能够去除兔、牛和猪红细胞上的异种抗原决定簇αGal,清除率达到99.9%(猪)和98.7%(牛),因此SsCBM+GH16结构域蛋白与GalC相同,是内切β-半乳糖苷酶。本文采用气相扩散悬滴法对SsGH16结构域蛋白进行了蛋白结晶的初步探索和优化,获得了0.21×0.17×0.33 mm左右的菱形晶体,晶体表面平整,三维立体明显,重复性较好。综上所述,本研究不仅加深了对SSU050630在SS2利用宿主N-聚糖的机制的理解,也为SSU050630在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制研究奠定基础,同时对降低异源移植排斥提供了一种新的手段。