论文部分内容阅读
第一部分NSUN2对阿霉素诱导心肌损伤的作用目的:研究NSUN2对阿霉素诱导心肌损伤的作用。方法:分别从体内和体外探讨NSUN2对阿霉素诱导心肌损伤中的作用。体内实验:选取10周龄SPF级C57BL/6J野生型小鼠20只,随机分为盐水注射组(Control组)及DOX注射组(DOX组),DOX组腹腔注射阿霉素(DOX)20mg/Kg(0.9%生理盐水稀释阿霉素至2mg/ml),Control组腹腔注射等量生理盐水,3天后在异氟烷吸入全麻下进行小动物心脏超声检查后取材;HE染色检测小鼠心脏组织病理变化;Western blot检测小鼠心脏组织内凋亡蛋白(Bax、BCL-2)水平变化,Western blot和ELISA分别检测小鼠心脏组织和血清内NSUN2的表达变化。体外实验:野生型H9C2细胞、si NSUN2转染H9C2细胞、腺病毒转染人源NSUN2建立NSUN2稳定过表达H9C2细胞系,加入阿霉素500ng/ml共培养24小时后,用DCFH-DA探针、Western blot、免疫荧光、TUNEL染色等方法检测细胞的ROS、凋亡及NSUN2的变化,ELISA检测细胞培养基上清内NSUN2表达变化。结果:体内实验:DOX组小鼠生存率、体重、心重胫骨比值、左室射血分数LVEF%和左室短轴缩短率LVFS%均较Control组明显下降(P<0.01);HE染色显示DOX组心脏组织水肿明显、炎细胞浸润增多,出现肌丝断裂、心肌纤维排列紊乱;Western blot结果显示:DOX组与Control组比较小鼠心脏组织内促凋亡蛋白Bax表达升高(P<0.01),抑凋亡蛋白BCL-2表达下降(P<0.01);Western blot、免疫组化、ELISA结果均显示DOX组小鼠细胞内及血清内NSUN2表达水平较Control组升高(P<0.01)。体外实验:Western blot结果显示DOX组与Control组比较H9C2细胞Bax蛋白水平及NSUN2表达水平升高(P<0.01),BCL-2蛋白水平下降(P<0.01);ELISA检测细胞培养液内NSUN2表达水平较Control组升高(P<0.05);TUNEL结果显示DOX组细胞凋亡明显增加;DCFH-DA探针检测DOX组细胞内活性氧(ROS)水平较Control组明显升高;H9C2细胞敲减NSUN2后,DOX组细胞内Bax蛋白水平较Control组升高(P<0.01),BCL-2蛋白表达水平下降(P<0.01);NSUN2过表达后,DOX组细胞内Bax表达水平较Control组下降(P<0.01),BCL-2表达水平升高(P<0.01)。结论:阿霉素诱导心肌损伤后ROS、凋亡均增加,NSUN2表达水平上调,NSUN2沉默后的阿霉素诱导H9C2细胞凋亡增加,过表达NSUN2后的阿霉素诱导H9C2细胞凋亡下降。因此暗示NSUN2能抑制阿霉素诱导的心肌损伤。第二部分NSUN2通过Nrf2介导的抗氧化应激能抑制阿霉素诱导的心肌损伤目的:探讨NSUN2通过Nrf2介导的氧化应激抑制阿霉素诱导心肌损伤过程中的可能机制。方法:体内实验:选取6周龄SPF级C57BL/6J野生型小鼠28只,随机分两组:AAV9-sh NC组、AAV9-sh NUSN2组,异氟烷全麻后进行小动物超声检查心脏功能两组无差异,AAV9-sh NC组通过尾静脉注射sh NC AAV9病毒5×1011vg/只,AAV9-sh NUSN2组通过尾静脉注射sh NSUN2 AAV9病毒5×1011vg/只,4周后在异氟烷吸入全麻下进行小动物超声检测心脏(左室长轴切面、左室短轴切面、四腔心切面),然后再分别随机分为两组:NS组和DOX组,DOX组腹腔注射阿霉素20mg/Kg(0.9%生理盐水稀释DOX至2mg/ml),NS组腹腔注射等量生理盐水,3天后在异氟烷吸入全麻下行小动物超声检查后取材,对组织进行Western blot、免疫组化、免疫荧光等检测BAX、BCL2、Nrf2、HO1、NQO1、NSUN2等指标,TUNEL染色检测小鼠心脏组织的凋亡情况。体外实验:H9C2细胞通过敲减和过表达NSUN2,用Western blot、免疫荧光等方法检测NSUN2、Nrf2、HO1、NQO1和m5C等指标,Dot blot检测m5C甲基化修饰,加更生霉素检测NSUN2对Nrf2 m RNA的稳定性,Me RIP检测m5C特异性抗体富集Nrf2 m RMA的程度,甲基化酶抑制剂处理后Nrf2 m RNA表达变化。结果:体内实验:小动物心脏超声检测显示:AAV9-shNUSN2组小鼠心脏指标LVEF%、LVFS%和AET较AAV9-sh NC组下降(P<0.05),LVIDD、LVIDS、LVed Vol、LVes Vol增加(P<0.05),AAV9-sh NSUN2-DOX组小鼠左室射血分数LVEF%和左室短轴缩短率LVFS%较AAV9-sh NC-DOX组下降更明显(P<0.01);AAV9-sh NSUN2-DOX组小鼠心重胫骨比值较AAV9-sh NC-DOX组减少(P<0.01);ELISA提示AAV9-sh NSUN2-DOX组小鼠血清内NSUN2无升高,AAV9-sh NC-DOX组小鼠血清内NSUN2升高(P<0.05);HE染色提示AAV9-sh NSUN2-DOX组小鼠心脏损伤较AAV9-sh NC-DOX组比较加重;免疫荧光提示AAV9-sh NSUN2-DOX组小鼠心脏内Nrf2升高水平较AAV9-sh NC-DOX组下降;Tunel染色提示CAAV9-sh NSUN2-DOX组小鼠心脏组织凋亡水平增加。体外实验:CCK8法检测H9C2细胞增殖显示si NSUN2转染降低H9C2细胞的增殖水平(P<0.01),过表达NSUN2加速H9C2细胞的增殖(P<0.01);Western blot、免疫荧光显示si NSUN2-DOX组Nrf2、HO1蛋白表达水平较si NC-DOX组下降,si NSUN2转染组较si NC转染组细胞内Nrf2、HO1、NQO1蛋白表达水平降低,NSUN2 Vector组较Control Vector组细胞内Nrf2、HO1、NQO1蛋白表达水平升高;免疫荧光、Dot blot显示阿霉素诱导H9C2细胞内m5C修饰水平升高;PCR显示:NSUN2 Vector组较Control Vector组Nrf2 m RNA半衰期延长(P<0.01);Me RIP提示m5C特异性抗体可以大量富集Nef2 m RNA,甲基化抑制剂可以减少Nrf2 m RNA的水平。结论:心脏组织中NSUN2能促进心肌细胞的增殖,NSUN2可能通过m5C甲基化稳定Nrf2 m RNA激活抗氧化应激从而起抑制阿霉素诱导心肌损伤的作用。