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SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)是组蛋白3第4位赖氨酸二甲基化、三甲基化(H3K4me2/3)特异性转移酶,具有执行甲基转移酶活性的SET结构域和参与蛋白互作、识别特异DNA序列的MYND锌指基序。SMYD3通过结合靶基因启动子区序列催化形成H3K4me3活性转录标志,而调节其下游一系列基因的激活和表达,其中包括端粒酶逆转录酶等。牛卵母细胞体外成熟过程中一直维持H3K4me3修饰状态。目前只发现两种特异性催化H3K4me3的酶SMYD3和Meisetz。Meisetz只在两性生殖细胞减数分裂前复制期到粗线期过程中表达,粗线期后不再表达,说明粗线期后有其他特异性甲基转移酶维持H3K4me3修饰状态,其中,SMYD3可能在这一过程中起重要作用。SMYD3的作用机理在癌细胞中已被广泛研究,但在卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育过程中的研究还很有限。本实验首先对牛卵母细胞体外成熟过程中SMYD3基因的mRNA和蛋白质水平的动态变化进行了研究;同时针对SMYD3 mRNA上游、中游、下游设计抑制位点专一性的短干扰RNA片段(shortinterference RNA,siRNA),对牛GV期去颗粒细胞卵母细胞进行联合注射,研究在成熟过程中干扰SMYD3 mRNA表达对牛卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育的影响;并对体外受精7h的合子进行注射,研究受精后干扰SMYD3 mRNA表达对早期胚胎发育的影响。1、牛卵母细胞成熟过程中SMYD3基因mRNA和蛋白质的动态变化在本研究建立的体外培养系统中,0、8、12、18、24 h分别有82.9%、80.3%、75.1%、63.3%、70.9%比例的卵母细胞处于GⅤ期、PMⅠ期、MⅠ期、AⅠ-TⅠ期、MⅡ期。根据以上数据,可用0、8、12、18、24 h体外培养时间作为收集处于减数分裂GⅤ期、PMⅠ期、MⅠ期、AⅠ-TⅠ期、MⅡ期的卵母细胞的依据。用荧光实时定量PCR检测SMYD3 mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中表达的结果显示:牛SMYD3 mRNA在牛卵母细胞减数分裂各时期持续表达,相对于GⅤ期,表达水平在MⅠ期、AⅠ-TⅠ期明显升高(P＜0.05),AⅠ-TⅠ期后到MⅡ期逐渐下降,但差异不显著(P＞0.05)。免疫化学方法检测SMYD3蛋白表达结果表明:SMYD3在AⅠ-TⅠ期大量翻译蛋白并到MⅡ期蛋白量持续上升,且始终围绕在染色体的周围。说明SMYD3 mRNA的积累主要在AⅠ-TⅠ期之前完成,蛋白的大量合成和发挥作用始于AⅠ-TⅠ期,可能对维持后期H3K4me3基因转录激活信号的形成起关键作用。在SMYD3 mRNA表达的研究中,检测到一个未见报道的SMYD3转录本。测序结果与基因组DNA全序列比对,发现该转录本位于此基因7号内含子DNA序列9803-9913bp,符合真核生物GT-AG传统剪接方式,也可作为外显子进行转录。进一步研究显示来自不同个体的卵母细胞或来自同一个体的不同组织肝脏、肺脏、睾丸、脾脏及心脏都存在相同的转录本,表明SMYD3此种可变剪接无个体和组织特异性。2、干扰SMYD3 mRNA表达对牛卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育的影响本实验针对牛SMYD3 mRNA的第281-299、567-585、1030-1048bp区域分别设计siRNA干涉序列,三片段联合对GⅤ期去颗粒细胞的裸卵进行显微注射,培养24 h后SMYD3 mRNA的表达量与对照组相比下降到18%,干扰效率显著。GⅤ期去颗粒细胞的裸卵注射SMYD3-siRNA研究结果表明:SMYD3-siRNA注射组与阴性对照Nos-siRNA注射组(无义干扰片段)成熟率无显著差异(67.14%vs66.06%,P＞0.05),说明干扰SMYD3 mRNA的表达不影响卵母细胞的成熟。非注射对照组卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexs,COCs)和GⅤ期去颗粒细胞裸卵(Denuded oocytes,DOs)的成熟率无显著差异(75.54%vs 76.19%,P＞0.05),说明GⅤ期机械去除颗粒细胞不影响卵母细胞成熟;但注射组与非注射组体外成熟率差异极显著(67.14%、66.06%vs 75.54%、76.19%,P＜0.01),可能是由于显微注射操作过程中的机械损伤造成。GⅤ期进行胞质注射SMYD3-siRNA实验组、注射Nos-siRNA阴性对照组及非注射组对照组COCs、DOs各组卵母细胞体外成熟培养22 h后进行体外受精。结果显示:SMYD3-siRNA注射组、DOs组、Nos-siRNA注射组之间卵裂率均无显著差异(44.07%vs 42.8%vs 42.95%,P＞0.05);但SMYD3-siRNA注射组的8细胞率、囊胚率显著低于DOs组、Nos-siRNA注射组(3.29%vs 17.51%、12.82%;0%vs10.89%、8.33%,P＜0.01),表明GⅤ期去颗粒细胞裸卵注射SMYD3-siRNA不影响卵母细胞的受精和卵裂,但显著降低8细胞率和囊胚率,可能是因为SMYD3激活了某些在胚胎由2细胞到囊胚发育过程中起重要作用的基因。而DOs与Nos-siRNA注射组的8细胞率、囊胚率均无显著差异(17.51%vs 12.82%,10.89%vs 8.33%,P＞0.05),说明显微注射的机械损伤对实验结果没有影响。另外,COCs与DOs、Nos-siRNA注射组、SMYD3-siRNA注射组的卵裂率、8细胞率、囊胚率差异均极显著(66.95%vs 42.8%、42.95%、44.07%;40.34%vs17.51%、12.82%、3.29%;30.47%vs 10.89%、8.33%、0%,P＜0.01),说明颗粒细胞对卵母细胞的体外受精过程有重要作用。此外,本研究对经体外成熟并受精7 h后的合子进行SMYD3-siRNA注射实验,结果表明:SMYD3-siRNA注射组与对照组非注射受精卵、Nos-siRNA注射组的卵裂率、8细胞率、囊胚率均无显著差异(55.88%vs 56.88%vs 58.43%;32.35%vs 34.94%vs 31.90%;23.83%vs 29.0%vs24.01%,P＞0.05)。说明SMYD3影响胚胎由2细胞到囊胚发育的机能不是在受精后建立的。综上所述,GⅤ期去颗粒细胞裸卵干扰SMYD3 mRNA表达后不影响牛卵母细胞体外成熟、受精及卵裂,但严重降低2细胞胚胎到囊胚的发育,而受精后7 h再干扰合子的SMYD3 mRNA表达对卵裂、2细胞、8细胞及囊胚的发育都没有影响。由此说明,SMYD3通过激活某些在胚胎从2细胞到囊胚正常发育中起重要作用的基因来调节发育,并且这种影响是在卵母细胞成熟晚期而非受精后建立的。本研究为SMYD3在卵母细胞成熟、受精及胚胎的发育过程中调节机理的研究提供了一定的基础。