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聚合酶链式反应(PCR)技术是生物医学研究中的基本实验手段,自从其发明以来,人们对其改进的研究就没间断过。本课题主要是把一种纳米材料碲化镉(CdTe)量子点作为添加剂加入PCR体系中,研究其对聚合酶链式反应的影响。 本课题主要从四个方面对CdTe量子点作为PCR的添加剂的可行性进行了分析。第一,CdTe量子点对PCR影响的实验模型和实验条件的建立;第二, CdTe量子点对普通PCR特异性和灵敏度及稳定性的影响研究;第三,CdTe量子点对Q-PCR特异性和灵敏度及稳定性的影响研究;第四,CdTe量子点对PCR扩增忠实性的影响研究。 (1)CdTe量子点最佳添加浓度的摸索:采用浓度梯度的方式确定CdTe量子点的最佳浓度为0.0833mg/ml,并针对CdTe量子点对普通PCR的影响和CdTe量子点对Q-PCR(实时定量PCR)的影响,确立了本课题所需要的实验的模型。 (2)CdTe量子点对普通PCR的影响。实验结果表明,当CdTe量子点浓度为0.0833mg/ml时对PCR有明显的增效作用,表现在产物产量的增加,灵敏度提高100倍,特异性增强,且稳定性测试在第三轮仍有扩增。不同CdTe量子点对PCR的影响:从3种尺寸相近的不同CdTe量子点对PCR的产量与退火温度方面着手,实验结果表明不同 CdTe量子点对PCR产量的影响是不同的,但是对PCR退火温度的影响是相似的。 (3)CdTe量子点对Q-PCR的影响。第一,最佳浓度的CdTe量子点对Q-PCR的影响与对普通PCR的影响一致,即能够提高PCR的产量,灵敏度,特异性。第二,不同浓度CdTe量子点对Q-PCR的影响,向PCR体系中分别加入0μl,0.4μl,1μl,4μl,7μl的1mg/ml的Cdte量子点,则在12μl中的量子点的浓度依次为0mg/ml,0.033mg/ml,0.0833mg/ml(最佳浓度量子点),0.33mg/ml,0.5833mg/ml,当CdTe量子点超过最佳添加浓度时,对PCR有抑制作用。第三,不同CdTe量子点对Q-PCR的影响的实验,在普通PCR的基础上,对两种不同CdTe量子点进行比较实验,得出结论尺寸小一点的CdTe量子点的灵敏性比尺寸大的高。第四,Q-PCR的稳定性实验,主要通过Q-PCR的重现性来测试的,实验结果表明添加CdTe量子点的PCR实验具有可重复性。 (4)CdTe量子点的保真性检测实验中,通过Rpsl体内测试和体外测试两种方法得出CdTe量子点能够使PCR的忠实性下降。表明其具有一定的分子毒性。但是通过DNA测序显示其并没有引起PCR产物序列明显的变化。 本研究的主要创新点是:CdTe量子点可有效用于Q-PCR,并结合荧光染料SYBR GreenI和Eva Green的使用,已研制出新型的Q-PCR试剂盒。该试剂盒已经投入到产品生产中。