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动脉粥样硬化斑块不稳定是导致不稳定性心绞痛、急性心肌梗死、心源性猝死等冠心病临床急症的根本原因,严重时斑块发生破裂,暴露了内膜下致凝成分和高度促凝的脂质核,导致血栓形成及相应的冠状动脉急性灌注不足,从而引起缺血性心血管事件。斑块纤维帽的完整性是动脉粥样硬化斑块不稳定、进展至破裂的关键所在,而斑块纤维帽的完整性主要依赖于细胞外基质(extracellar matrix, ECM)合成/降解的动态平衡。ECM是纤维帽的主要成分,其降解贯穿于动脉粥样硬化发生发展的整个过程,而基质金属蛋白酶(MMPs)则是调控ECM合成/降解的动态平衡最重要的酶系,主要包括间质胶原酶(interstitial collagenase, MMP-1),明胶酶A (gelatinase A, MMP-2),明胶酶B (gelatinase B, MMP-9)及膜型基质金属蛋白酶(MT-MMP, MMP-14)。MMPs以无活性的酶原形式分泌,主要由其他蛋白酶如纤溶酶等激活。单核-巨噬细胞激活堆积和泡沫细胞形成浸润是导致动脉粥样硬化斑块不稳定另一重要因素。动脉粥样硬化被看作是巨噬细胞对病理性的脂蛋白入侵血管壁的炎症反应,巨噬细胞吞噬脂质导致胞内脂质堆积形成泡沫细胞是动脉粥样硬化的关键一步,影响着动脉粥样硬化的的发生发展。研究显示,与未破裂的动脉粥样硬化斑块纤维帽相比,破裂的纤维帽内有大量巨噬细胞和泡沫细胞浸润,巨噬细胞通过分泌蛋白水解酶,包括基质金属蛋白酶家族(MMPs,胶原酶,明胶酶和基质溶酶)和纤溶酶原激活剂削弱细胞外纤维帽基质,使斑块出现溃疡和裂缝,启动凝血过程、堵塞动脉血管、引起猝死及心肌梗死等临床事件发生。因此,降低MMPs水平及活性、减少纤维帽ECM降解、阻断巨噬细胞活化、抑制泡沫细胞形成以及阻断巨噬细胞产生蛋白水解酶的活性,可以达到稳定斑块和减少斑块破裂后血栓形成的作用。组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2, TFPI-2)是一类含Kunitz结构域的蛋白酶抑制剂,70~75%的TFPI-2与ECM结合而定位于ECM。TFPI-2对纤溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶和FXa具有的强烈抑制作用,通过抑制纤溶酶和胰蛋白酶,阻止ECM中的基质金属蛋白酶原(proMMPs)活化为MMPs,从而抑制MMPs的活性,使其不能水解ECM中的大分子物质,减少ECM的降解。因而,TFPI-2作为MMPs活性的内源性抑制物,在维持和调控ECM重塑过程中起到关键的作用,可能具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用。尽管TFPI-2在血栓形成中的重要性未得到肯定,但是近年来在体外研究发现TFPI-2与TF:FVIIa的相互作用可能与细胞增殖有关;而且TFPI-2可以促进血管平滑肌细胞的增殖;TFPI-2还是内皮细胞促血管新生的负向调节因子,具有治疗异常血管新生性疾病的潜力。凋亡在健康组织的维持和更新中起到关键作用,最近有研究报道,TFPI-2通过Caspase介导促凋亡信号通路的激活诱导U-251细胞凋亡。我们前期的研究发现,在U937泡沫细胞形成过程中,TFPI-2的mRNA和蛋白水平在oxLDL加入6小时左右达峰然后逐渐下降,U937泡沫化后TFPI-2水平较低。因此,TFPI-2可能具有促进巨噬细胞凋亡、抑制泡沫细胞形成的作用,从而延缓动脉粥样硬化的进展。我们首先在动脉硬化动物模型(ApoE-/-小鼠)体内(in vivo)采用肌肉注射加电击转染的方法有效上调TFPI-2水平,建立稳定上调TFPI-2水平的动脉硬化动物模型;然后再在稳定上调TFPI-2水平的动脉硬化动物模型中观察TFPI-2对动脉粥样硬化斑块稳定性(主要观察指标为:纤维帽连续性、埋入式纤维帽、纤维帽的厚度、坏死脂质核心的大小等)的作用,以及观察斑块的稳定性与斑块内MMPs表达、斑块形成进展相关的信号通路(PPAR-y. NF-κB和PIKy/PKB)激活的关系。然后,我们在体外(in vitro)以不同浓度梯度(0,1.25,2.5,5.0,10.0μg/mL)重组TFPI-2蛋白干预U937源性巨噬细胞及U937源性巨噬细胞泡沫化过程。通过BrdU标记法、Hoechst染色、Annexin V/PI双染及流式细胞仪定量检测观察TFPI-2对U937源性巨噬细胞增殖和凋亡的作用,并检测其对细胞凋亡通路(Fas/FasL)的作用;通过油红“O”染色及高效液相色谱法(HPLC)观察TFPI-2对U937源性泡沫细胞形成的影响,检测其对泡沫细胞形成通路(PPARγ、ABCG1、ApoA I等)的作用。我们在体内的研究结果显示,通过采用肌肉注射加电击转染的方法,成功地建立了稳定上调TFPI-2水平的动脉硬化动物模型,转染后ApoE-/-小鼠血清TFPI-2水平提高约2-3倍,斑块内TFPI-2水平也明显提高。其次,TFPI-2表达上调后可以显著减少ApoE-/-小鼠斑块脂质核心表面积、纤维帽层数和斑块破裂数量,显著增加纤维帽厚度,从而增加了斑块的稳定性,其机制可能与下调MMP-2,9表达水平、提高TFPI-2/MMPs比值及抑制PIKγ/PKB通路的激活有关。同时,体外研究结果发现,TFPI-2对巨噬细胞增殖无明显作用,但具有促进巨噬细胞凋亡,呈剂量依赖性,主要通过增加FasL表达、增加FasL与Fas结合、激活Caspase-8介导巨噬细胞凋亡,而Fas/FasL凋亡信号通路的激活可能与TFPI-2抑制巨噬细胞MMPs表达有关。其次,TFPI-2具有抑制泡沫细胞形成的作用,呈剂量依赖性,主要通过激活PPARγ、促进细胞内胆固醇通过ABCG1流出到ApoAⅠ抑制泡沫细胞形成,而PPARy的激活可能与TFPI-2抑制MMPs表达和活性有关。我们的研究结果初步表明TFPI-2具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用,其机制可能与下调MMP-2,9表达水平、上调TFPI-2/MMPs比值、抑制PI3Kγ/PKB通路的激活及促进巨噬细胞凋亡和抑制泡沫细胞形成有关。因此,TFPI-2有可能成为急性冠脉综合症的防治的新的靶点。