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糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus,P.ostreatus）是我国栽培量最大、栽培范围最广的食用菌,其产量和品质显著受到氮素供应水平的影响,但是目前对糙皮侧耳氮素吸收、转运、同化等的分子机制尚不清楚。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）是生物体氮素同化的关键酶,本文通过对P.ostreatus PC 15菌株的基因组分析获得了 1个编码谷氨酰胺合成酶的假定基因（GS99）。为了深入研究GS99基因的功能,本文以河南省广泛栽培的糙皮侧耳新831菌株为研究对象,首先克隆获得了GS99基因完整的gDNA片段和CDS片段,并进行了测序分析和生物信息学分析;然后构建了GS99基因的原核表达载体pET22b-GS99,并进行了蛋白的诱导表达、纯化和酶学性质分析;通过Native-PGAE和凝胶渗透色谱（GPC）分析技术对GS99蛋白进行分子量和构型分析;利用RT-qPCR对GS99基因进行了时空表达分析,并测定了子实体不同部位营养组成及氨基酸组成;最后构建了GS99基因的过表达和反义沉默载体pTHG1300-ovGS99和pTHG1300-siGS99。本研究的主要结论如下:1.分别以P.ostreatus New 831菌株的菌丝体DNA和cDNA为模板,成功克隆获得GS99基因的全长gDNA片段（1,390 bp）和CDS片段（1,062 bp）,GenBank登录号为MG680443.1。生物信息学分析结果显示,GS99基因由一个5’UTR,4个内含子和5个外显子组成,编码353个氨基酸;GS99蛋白为同源十聚体,其单体大小和等电点分别为39.05 kDa和5.95;GS99蛋白具有GSII家族保守的N端结构域gln-synt N、C端催化结构域gln-synt C、ATP结合功能结构域和Glycine富集位点GLNA1,从而初步说明GS99基因的编码产物可能具有谷氨酰胺合成酶催化活性。2.构建了GS99基因的原核表达载体pET22b-GS99,并进行了诱导表达和SDS-PAGE分析,结果显示,GS99蛋白单体大小为39 kDa,与预期相符。利用镍柱亲和层析获得了纯度高于90%的GS99蛋白,Native-PAGE和GPC分析结果显示,GS99蛋白大小约为400 kDa,表明该蛋白为同源十聚体,与预测结果相符。3.对纯化获得的GS99蛋白进行谷氨酰胺合成酶酶学性质分析,结果显示,GS99蛋白的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和7.5;Mg2+离子可显著提高其活性,当Mg2+离子浓度高于40 mM时,其活性不再变化;Mn2+离子对其活性的影响表现为低促高抑,在浓度为5 mM时酶活力最高;低温预处理可提高GS99蛋白的催化活性,但高温使其失活。4.GS99基因在不同时期和不同部位均有表达,其在不同时期的表达模式为子实体期>菌丝期>原基期,其在子实体不同部位的表达模式为菌褶>菌盖>菌柄,由此表明,GS99基因不仅参与糙皮侧耳氮素的同化,而且与子实体的发育息息相关。另外,子实体不同部位间的营养组成存在显著差异,总氨基酸和总氮含量为菌褶>菌盖>菌柄,而总糖含量为菌柄>菌盖>菌褶;17种氨基酸的含量均为菌褶>菌盖>菌柄,且谷氨酸的含量最高、其次为天冬氨酸,因此,与其它生物类似,谷氨酸和天冬氨酸在糙皮侧耳中可能也发挥着氨基供体的功能。5.分别克隆获得P.ostreatus New 831菌株的β-tubulin和gpd基因启动子,通过融合PCR和酶切酶连的方法构建了该菌的过表达和反义沉默骨架载体pTHG1300,在此基础上,构建了GS99基因的过表达和反义沉默载体pTHG1300-ovGS99和pTHG1300-siGS99,为深入探究该基因在糙皮侧耳氮代谢和子实体发育中的作用机制奠定基础。