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果蝇的研究证明,胚胎发育的启动、体轴的建立等重要发育过程主要依靠母体来源的mRNA即母性基因的作用而实现。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目昆虫的模式生物,其早期胚胎发生与果蝇相比具有显著的差异性,研究家蚕的母性基因,对于了解家蚕胚胎发育的分子机制十分重要,也将对鳞翅目昆虫的发育与种群的遗传控制技术研究提供参考。本研究根据家蚕表达序列标签(EST)数据库,结合利用生物信息学技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从家蚕p50品种的未受精卵克隆获得了家蚕两个新基因的全长cDNA序列,对所获得的序列进行开放阅读框、外显子和内含子分析,预测了蛋白的理化性质、保守结构域并进行了分子进化分析。主要研究结论如下:一、家蚕AP-4(Activator Protein 4)基因的克隆与分析1.克隆获得了家蚕AP-4基因全长cDNA。长度为1621 bp,其中包括318 bp的5′端非编码区(5′UTR)、993 bp的蛋白质编码区、终止密码子TGA和307 bp的3′端非编码区(3′UTR)。ORF从cDNA的319位起,在1314位终止,长度为996 bp,编码331个氨基酸。2.家蚕AP-4基因ORF位于家蚕基因组Ctg022100(GenBank No:AADK01022100)的1430～5674 bp之间。该基因由3个外显子和2个内含子组成,内含子长度分别为2763 bp和481 bp,3个外显子分别位于cDNA的1～407位,408～570位,571～1621位。3.对赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、蜜蜂(Apis mellifera)、家蚕、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和人(Homo sapiens)的AP-4同源氨基酸序列进行比对分析表明,各物种在45-99Aa区域高度相似,表明该区域有很高的保守性,是一个典型的保守结构域,推测其在AP-4的生物学功能实现上起到重要作用。对AP-4的分子进化分析表明,家蚕AP-4蛋白氨基酸序列与棉铃虫AP-4蛋白进化关系最近,蛋白同源性达76%,分值为449,e值为4e-124。4.利用实时定量RT-PCR技术分析了家蚕AP-4基因在不同发育时期的的表达水平。该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除蚁蚕和蛹期第4天未能检测到表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。推测家蚕AP-4基因可能是以一种短暂的、不连续的表达模式发挥着调节作用。二、家蚕Bmfezl基因的克隆与分析1.克隆获得了家蚕Bmfezl基因全长cDNA。长度为1823 bp,其中包括184 bp的5′端非编码区(5′UTR)、1383 bp的蛋白质编码区、终止密码子TAA、228 bp的3′端非编码区(3′UTR)和25 bp的polyA尾。ORF从cDNA的185位起始,在1569位终止,长度为1386 bp,编码461个氨基酸。2.家蚕Bmfezl基因由7个外显子和6个内含子组成,初步分析该基因覆盖了至少两个家蚕基因组Scaffold000276(GenBank No:CH379861.1)和Scaffold000435(GenBank No:CH380020.1)。3.对家蚕Bmfezl基因cDNA编码的蛋白质利用ExPASy进行结构域分析,发现在205–435Aa区域存在典型的亮氨酸拉链结构域fez1。家蚕Bmfezl基因编码蛋白的分子进化分析结果表明,家蚕Bmfezl基因编码蛋白与推定的赤拟谷盗(Tribolium castaneum)肿瘤抑制因2(tumor suppressor 2ref|XP 966525.1)具有最近的亲缘关系,蛋白的同源性为35%,分值为241,e值为2e-61。4.根据其它物种Fezl蛋白功能的研究结果,推测家蚕未受精卵Bmfezl基因产物在家蚕胚胎发育早期的细胞周期的调节、细胞微管的集合等方面发挥重要作用。