研究目的:高血压是一种多因素疾病,多种细胞或者细胞因子等都参与其发病进程。随着人口老龄化和生活方式的改变,高血压的发病率呈现增高的严峻态势,高血压已然成为全球性的重要公共卫生问题。由高血压带来的各种心脑血管疾病以及其相关的并发症则成为严重威胁世界人民群众身心健康,临床迫切需要解决的关键问题。既往研究已知炎症反应和免疫系统参与了高血压进程,而且已经得到的广泛认可。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种导致高血压和靶器官损害的主要介质和血管活性肽。另外,通过以往研究我们也已经明确,T淋巴细胞参与了炎症反应和免疫反应,并在高血压的病理进程中具有重要的调节作用。而胸腺作为一个十分重要的免疫器官,以及T细胞发育成熟的重要位点,虽然随着年龄增长,胸腺功能逐渐减退,但其依然具有一定的生理功能,可以继续促进新的T细胞的产生,尤其近来国内外很多研究揭示:通过调节相关转录因子FoxN1逆转胸腺衰老可奇迹般逆转小鼠的整体衰老,有牵一发而动全身的功效,这就激发了研究人员的无限遐想。既往有研究结果显示,高血压小鼠可能存在胸腺功能减退的情况。说明胸腺与高血压进展可能存在密切相关性,那么高血压本身的病理进程是否会导致胸腺功能减退加速衰老,以及其可能的相关的机制都不清楚,而通过逆转胸腺衰老则是否能够影响高血压进程亦尚不清楚。本研究通过血管紧张素Ⅱ诱导小鼠高血压模型,观察高血压小鼠胸腺功能的改变,随后通过胸腺移植等技术进行干预,观察上述操作对高血压进程及其靶器官的影响,并通过体外培养胸腺上皮细胞(TEC)探讨其中可能存在的机制,从而为临床治疗高血压提供新的诊疗方案和治疗靶点。研究方法:本研究动物实验共分为两个大部分,第一部分在体实验,将45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,随机分为正常对照组(Con组,n=15)、假手术组(Sham组,n=15)和Ang Ⅱ诱导的高血压模型组(HTN组,n=15)。高血压模型组采用皮下植入装有Ang Ⅱ溶液的微泵诱导而成,植入微泵后第三天开始每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续8周记录血压数据,处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、脾脏、心脏和肾脏等器官或组织。第二部分分为在体实验和体外实验,其中在体实验:45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,先被随机分为两组,正常对照组(Con组,n=15)和Ang Ⅱ诱导的高血压模型组(n=30)。连续鼠尾无创测压4周后,明确建模成功后再将高血压模型组随机分为高血压组(HTN组,n=15)和移植组(HTN+Trans组,n=15)。分离出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺组织,将其切成小块移植至移植组小鼠另外一侧(与植入微泵相反一侧)的肾包膜下,移植后3天继续每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续5周记录血压数据,并应用心脏超声检测小鼠心脏功能,然后处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、心脏、脾脏和肾脏等器官或组织。流式细胞仪分析外周血和脾脏T细胞亚群的百分比,以及胸腺细胞皮质胸腺上皮细胞(cTEC)和髓质胸腺上皮细胞(mTEC)比值(cTEC/mTEC);实时定量PCR检测胸腺FoxN1、Aire、sjTREC和ATRAP表达水平;Western Blot检测小鼠胸腺FoxN1、Aire和ATRAP的蛋白水平;以及对胸腺、脾脏、心脏和肾脏组织进行HE染色,并通过免疫组化方式检测胸腺FoxN1的水平;体外试验:将出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺在无菌条件下取出,然后进行胸腺上皮细胞(TEC)的培养,胸腺上皮细胞被分为空白对照组(即无刺激)、Ang Ⅱ刺激48h组和Ang Ⅱ刺激48h后与无刺激的TEC共培养组,然后取样以提取RNA和蛋白,检测FoxN1和ATRAP mRNA表达水平和蛋白水平。实验结果:1、HTN组收缩压(SBP)与舒张压(DBP)明显高于Con组和Sham组(p<0.05),Con组与Sham组血压没有差异,HTN+Trans组血压低于HTN组(p<0.05)略高于Con组(p>0.05)。在第一部分小鼠在体实验中,HTN组小鼠胸腺指数低于Con组和Sham组(p<0.05),Con组和Sham组无差异;在第二部分小鼠在体实验中,与Con组比较,HTN组小鼠胸腺指数明显下降(p<0.01),脾脏指数和肾脏指数升高(p<0.05),左室心脏比明显升高(p<0.01);与HTN组比较,HTN+Trans组小鼠胸腺指数明显升高(p<0.01),脾脏指数、肾脏指数和左室心脏比下降(p<0.05)i;HTN+Trans组小鼠左室心脏比高于Con组(p<0.05)。2、与Con组比较,HTN组LVEF、FS和SV均下降(p<0.05),ESV升高(p<0.05);HTN+Trans组LVEF、FS和SV高于HTN组,ESV低于HTN组(p<0.05),与Con组无差异。3、在第一部分中,与Con组小鼠相比较,HTN组小鼠胸腺衰老相关基因FoxN1和Aire的表达下调(P<0.05),HTN组小鼠sjTREC的含量亦下降(p<0.05),其余各组无明显统计学差异。在第二部分中,与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1、Aire、ATRAP和Thymosin beta4的表达下调(p<0.05),HTN组胸腺sjTREC的含量也减少(p<0.05),然而HTN组脾脏sjTREC的含量增加(p<0.05),余无统计学差异。4、流式分析结果显示,第一部分中HTN组小鼠外周血和脾脏TEM明显高于Con组和Sham组(p<0.05),HTN组小鼠脾脏na?ve T细胞低于Con组和Sham组(p<0.05),余无差异。第二部分中HTN组小鼠外周血和脾脏组织TEM明显高于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠外周血na?ve T细胞低于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠cTEC/mTEC比值高于Con组,低于HTN+Trans组(p<0.05)。5、与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1和Aire,以及ATRAP的蛋白表达水平明显下调(p<0.01),其中与Con组比较,HTN+Trans组FoxN1的蛋白水平下降(p<0.05),余无差异。6、胸腺HE染色,结果显示,各组小鼠胸腺均出现不同程度的典型退化萎缩表现,其中高血压组小鼠出现胸腺上皮间室的典型退化萎缩最为严重,皮质和髓质区域之间的区别减少以及胸腺小岛数量减少,而高血压移植组,胸腺病理与正常对照组差异较小,胸腺退化程度较轻。肾脏HE染色,显示高血压组小鼠可见病变区域与正常组织区域界限明显,部分区域肾小管萎缩及间质发生纤维化,及以淋巴细胞及浆细胞为主的炎症细胞浸润;部分血管可见蛋白栓塞,个别肾小球萎缩,囊腔扩张,囊壁明显增厚。脾脏HE染色,显示Con组小鼠脾组织整体结构轻度异常,脾小结数量无轻度减少,个别脾小结萎缩,淋巴数量下降,小部分区域红髓白髓界限不清,但仍可见脾动脉,脾组织内可见大量中性粒细胞浸润;HTN组小鼠脾组织整体结构异常,组织大部分区域结构紊乱,无正常脾小结结构,红髓白髓界限不清,可见多核巨噬细胞及中性粒细胞增多;HTN+Trans组小鼠脾组织整体结构异常,但与高血压组比较相对较轻,脾小结数量减少,且部分区域脾小结萎缩;部分区域红髓白髓界限不清,组织无明显炎症细胞浸润,淋巴数量减少。心脏HE染色,显示高血压组心肌肥厚,左室肥厚指数和左心室壁厚度增大以及纤维化增多等;HTN组主动脉壁增厚(p<0.05),Con组和HTN+Trans组之间无差异。7、免疫组化HTN组胸腺皮质和髓质区域之间的区别减少,FoxN1染色减少,HTN组小鼠胸腺FoxN1荧光累计光密度值明显下降(p<0.01),HTN+Trans组明显改善。8、体外实验结果显示,与无刺激的blank组、给予Ang Ⅱ刺激和给予Ang Ⅱ刺激后共培养组比较,给予1μmol/L的血管紧张素Ⅱ刺激后,FoxN1和ATRAP的mRNA表达水平以及其蛋白水平均下调(p<0.05),给予Ang Ⅱ刺激后在共培养一段时间后的Co-culture组,与blank组无差异。结论:体外实验表明血管紧张素Ⅱ可以通过下调ATRAP的表达,进而下调胸腺FoxN1的表达,导致胸腺功能减退,共培养可改善其影响。在体实验结果显示Ang Ⅱ诱导的高血压小鼠存在胸腺功能减退,包括FoxN1、Aire和ATRAP的mRNA表达的下调和蛋白水平的下降,以及反映胸腺近期输出功能减弱的sjTREC含量的下降,T细胞亚群百分比的失衡和胸腺素β4的下调,从而导致或者加重高血压进程。通过胸腺移植,提高胸腺FoxN1的表达,可明显改善小鼠心脏功能,恢复和抑制血压的升高。其可能存在的潜在机制为胸腺移植上调胸腺发育至关重要的转录因子FoxN1的表达,进而引起ATRAP的表达上调,从而反过来影响血管紧张素Ⅱ对胸腺功能的影响,以及引起胸腺素β4的升高和sjTREC含量的增加,并且能够恢复T细胞亚群的正常百分比,从而改善和抑制血压的升高。