目的:　　膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在世界范围内，膀胱癌的发病率居恶性肿瘤的第十一位，其形成过程复杂，多种基因参与其中，可分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)、肌层浸润性膀胱癌(MIBC)和转移性膀胱癌，其中20～30％的新发病例是MIBC[1]。MIBC的治疗以根治性膀胱切除及盆腔淋巴结清扫为主，术后复发率高达30～45％，5年生存率为45～66％[2]。微转移灶是局部治疗MIBC失败的主要原因之一;约50％新诊断的MIBC患者已发生潜在的局部或远处转移，MIBC仅手术治疗效果有时并不理想，以及部分患者不能通过手术完全切除病灶，临床往往会辅以放、化疗为主的治疗手段。辅助化疗可以使病理分期明确、有转移证据的患者受益于系统化疗，减少局部复发或远处转移复发的可能性。因此，辅助化疗更早地被医生和患者接受，因为疾病相关病死率越高的患者从辅助化疗受益的程度也就越高。吉西他滨(Gemcitabine，GEM)是一种脱氧胞苷类似物.属嘧啶类，是细胞周期特异性抗肿瘤代谢类药物，主要作用于S期细胞，抑制DNA合成，并可阻止细胞由G1期进入S期。GEM在全身多系统恶性肿瘤中发挥了巨大的作用，已成为非小细胞肺癌、胰腺癌和肌层浸润性膀胱癌术后化疗的一线用药[3]。临床治疗中GEM常与其他药物联用，发展出一系列的联合治疗方案都收到了较好的效果。值得关注的是，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，难免会使正常细胞收到一定的损害，产生相应的毒副反应，如骨髓抑制，免疫功能下降等等。化疗药物带来的各种不良反应也影响了化疗的持续实施，同时患者的年龄、肾功能和经济状况也是影响接受化疗的原因。因此，在寻求杀伤癌细胞的同时，又可以增加或者重建免疫功能，成为了临床研究的新方向。　　现代研究证实，恶性肿瘤的患者往往存在不同程度的免疫功能缺陷[4,5]。理论上，人体强大的免疫系统通过细胞免疫机制产生排斥反应，使突变细胞在未形成肿瘤之前即被清除，实际上许多肿瘤仍可逃避宿主的免疫攻击而继续生长，主要原因是由于患者全身免疫和肿瘤部免疫微环境的变化，造成肿瘤的免疫逃逸。肿瘤与免疫系统之间存在复杂的相互作用[6]，表现在:①免疫系统通过免疫应答抑制肿瘤生长和进展;②免疫系统通过诱导的炎症反应反而促进肿瘤生长、存活和血管形成;③肿瘤利用免疫调节机制形成免疫抑制微环境，不仅抑制宿主免疫应答，而且形成了一道阻断抗肿瘤性免疫治疗的屏障。机体的抗肿瘤免疫效应机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面[7]，T细胞主导细胞免疫功能，是机体免疫对抗肿瘤的主力，NK细胞则具有非特异性抗肿瘤作用，二者在肿瘤细胞免疫中的地位越来越受到人们的重视;B细胞介导的体液免疫在抗肿瘤免疫中起协同作用。有证据显示肿瘤可以导致外周T细胞功能严重受损，降低循环T细胞的反应性从而导致机体免疫抑制[8]。在膀胱癌动物模型中，外周血中T淋巴细胞数量减少，尤其是在肿瘤组织T淋巴细胞数目减少更加明显，也是恶性肿瘤免疫逃逸的主要机制之一[9]。所以研究膀胱癌免疫功能抑制机制，在应用化疗药物有效治疗的同时，找到其免疫功能恢复的方法，对膀胱癌的预防和治疗有重要理论及临床意义。香菇多糖(Lentinan)是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，具有抗肿瘤的作用，进入人体后诱导T细胞产生一种具有免疫活性的细胞因子，增强体内自然杀伤细胞的活性，对肿瘤细胞起到防御和杀伤的作用[1]。　　目前，香菇多糖主要作为一种免疫辅助药物应用于临床，能配合其他抗肿瘤药物有效促进T、B淋巴细胞增殖，并激发自然杀伤细胞活性，部分研究发现其本身对实体瘤也有一定的抑制作用[11]，目前针对其抑制膀胱癌的作用鲜有研究，尤其是与吉西他滨联合应用抑制膀胱癌的研究尚无报道。本研究分别或联合应用化疗药物（吉西他滨）和免疫调节剂（香菇多糖）作用于膀胱癌细胞系T24，观察不同给药时序所产生的不同作用效果，进一步明确香菇多糖在体外实验中对T24细胞增殖和凋亡的影响作用，同时明确应用香菇多糖对吉西他滨抑癌效果起到增效、增敏的作用。另外，通过建立MB49鼠膀胱癌细胞C57BL/6小鼠模型，检测免疫相关细胞因子的分泌及T淋巴细胞分布时相改变从而探讨膀胱癌肿瘤免疫抑制发生的具体机制;检测膀胱癌小鼠经化疗治疗前后免疫功能变化情况，以及应用香菇多糖对免疫应答功能的改善情况。通过本课题的研究可了解香菇多糖增强吉西他滨抑制膀胱癌的作用;膀胱癌免疫抑制的分子机制，应用吉西他滨对免疫功能的影响以及应用香菇多糖对接受化疗的荷瘤小鼠免疫功能的影响及其作用机制，为膀胱癌的预防及治疗提供理论基础和新的思路。　　材料和方法:　　体外培养人膀胱癌细胞系T-24，采用MTT法检测不同浓度和作用时间的吉西他滨、香菇多糖单独对细胞的增殖抑制效应，绘制浓度-生长抑制率曲线，计算半数抑制浓度IC50; MTT法检测吉西他滨联合香菇多糖不同给药时序对T-24细胞的增殖抑制作用;Annexin-V-FITC/PI双标记染色法检测各实验组对细胞凋亡的影响及PI单染法检测各组对细胞周期的影响;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Survivin的表达变化。构建Mb49鼠膀胱癌细胞C57BL/6小鼠皮下成瘤模型，分别应用单药或联合用药模式，记录治疗后各组小鼠成瘤情况，绘制生长曲线、解剖小鼠、测量瘤重、取出脾脏及淋巴结，并通过细胞流式染色检测不同组别小鼠脾脏及脾周淋巴结CD3+ CD8+T细胞、CD3+ CD4+T细胞数量百分比;进一步检测抗原提呈细胞包括CD11B+ F4/80巨噬细胞、CD11b+ Gr-1单核髓系抑制细胞(MDSCs)、树突状细胞两个亚群CD11c+TRL4+ DC及CD11c+TRL9+ DC数量;以及调节性T细胞(Treg) CD4+ CD25+ Foxp3+、CD152+T细胞数量变化，动态观察C57BL/6小鼠Th1免疫应答的差异;通过ELISA检测培养上清IFN-γ、 IL-2、IL-10、TGF-β等细胞因子差异，进一步验证香菇多糖协同吉西他滨抑制膀胱癌的作用，应用吉西他滨化疗对免疫功能的影响，以及应用香菇多糖后免疫功能的变化和其可能的作用机制。实验数据采用-x±s表示，实验原始数据采用SPSS17.0软件统计分析，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，两变量相关分析采用Pearson相关分析，P＜0.05差异具有显著意义，P＜0.01差异具有极显著意义。　　结果:　　吉西他滨单独用药组对T-24细胞的增殖抑制作用呈现浓度依赖性和时间依赖性;香菇多糖单独用药组在其浓度＜80ug/ml时对T-24细胞的增殖抑制作用亦呈现浓度和时间依赖性，但当香菇多糖浓度达到80ug/ml时，T-24细胞对其产生耐药性，增加香菇多糖的药物浓度但抑制率无明显改变(P＞0.05)。MTT结果提示两药联合时对T-24细胞的抑制作用明显强于单一用药，结果差异明显，具有统计学意义(P＜0.05);且最佳给药时序为两者同时给药。Annexin-V-FITC/PI双标记染色法结果也提示两药同时处理T-24细胞时的凋亡率高于其他处理组(P＜0.01)。PI单染法结果示吉西他滨和香菇多糖单独用药组或两者联合用药组都能使S期细胞比例减少，G1期比例增加(p＜0.05)，其中吉西他滨单药或香菇多糖单独用药作用下停滞于G1期的细胞更多些，处于S期细胞更少些(p＜0.05)，但两者之间差异无统计学意义(p＞0.05)。Mb49鼠膀胱癌细胞移植可成功建立C57BL/6小鼠植瘤模型。给予香菇多糖辅助治疗后小鼠生存期较单用吉西他滨延长，肿瘤体积和肿瘤重量减小，给予香菇多糖可以大大提高抗肿瘤免疫应答增加CD3+ CD4+T细胞和CD3+ CD8+T细胞数量，促进IFNγ和IL-2分泌，增加CD11c+ TRL4+ DCs的百分比，还可促进CD11b+F4/80+巨噬细胞活化;香菇多糖的使用还可明显降低MDSCs数量，也可降低CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞数量，抑制IL-10分泌，组间差异明显，具有统计学意义(P＜0.05)。　　结论:　　体外实验证实，香菇多糖单独用药可以抑制膀胱癌细胞系T24增殖及诱导凋亡，吉西他滨与香菇多糖联合作用于人膀胱癌T-24细胞时，香菇多糖对吉西他滨起到增效、增敏的作用，对T-24的抑制增殖和诱导凋亡的作用明显大于单一用药，且最佳时机可能是两种药物同时作用于T-24细胞。　　应用香菇多糖后荷瘤小鼠生存期较单用吉西他滨延长，肿瘤体积和肿瘤重量减小，且可以大大提高抗肿瘤免疫应答，增加CD3+ CD4+T细胞和CD3+ CD8+T细胞数量，促进IFNγ和IL-2分泌，间接达到抗肿瘤的作用;而这这一作用可能是通过DCs活化，尤其是CD11c+ TRL4+ DCs的活化诱导有效的Th1细胞免疫应答而达到的，TLR4是介导MB49荷瘤小鼠DCs活化的重要模式识别受体;另外香菇多糖还可促进CD11b+F4/80+巨噬细胞活化，达到增强抗原提呈和直接杀伤肿瘤作用;在调节性免疫方面，香菇多糖的使用可明显降低MDSCs数量，也可降低CD4+ CD25+Foxp3+调节性T细胞数量，抑制IL-10分泌，从而使固有免疫和适应性免疫应答增强。因此给予香菇多糖辅助治疗使用香菇多糖辅助吉西他滨治疗后，能明显改善荷瘤小鼠及化疗后荷瘤小鼠的免疫功能，降低化疗药物的毒副作用，并增加抑癌作用效果。