论文部分内容阅读
黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前已发现的黄曲霉毒素中毒性最强的一种,其具有强肝毒性、高致突变性和高致畸性。广泛存在于农产品及饲料食品中,对人类健康存在严重威胁,同时对粮食和畜牧业造成严重的经济损失。AFB1具有非常稳定的理化性质,一般食品加工过程难以对其造成破坏。相对于物理法和化学法而言,生物降解AFB1反应条件较温和,不易造成营养的流失,也不会有产生新的毒素。细菌降解AFB1是一种有效、安全和环保的解毒方法。目前,生物降解AFB1的应用较少,尚未发现生物酶降解AFB1的相关应用。因而,分离高效降解AFB1的细菌具有重要的实际应用价值。本研究在筛选及鉴定高效降解AFB1的细菌菌株的基础上,优化降解AFB1的条件,并初步探讨其降解AFB1的作用机理,得到以下结果:(1)采用间接竞争ELISA方法测定培养液中AFB1含量,所得标准曲线相关系数>0.9990,加标回收率>98%,精密度<5%。在2.5μg/kg75μg/kg范围内线性较好。说明本实验所建立的方法简单便捷、准确可靠。适用于培养液中AFB1的检测。(2)使用香豆素代替AFB1做为唯一碳源,对AFB1降解菌株进行初筛实验,通过添加AFB1标准溶液,进行复筛实验。实验共计得到9株具备去除AFB1能力的菌株,其中去除能力最高的为鱼肠中分离出的YC2菌株。对YC2菌株细胞进行洗脱萃取,并测定细胞中AFB1的剩余量,确定了该菌株去除AFB1的过程为降解反应。(3)结合形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA基因序列测定分析对降解AFB1活性最高的菌株YC2进行鉴定。菌落呈现乳白色的圆形菌落,边缘整齐且薄,菌体中央微隆起,呈丘状,革兰氏阳性杆菌。并经过16S r RNA测序及系统进化树分析,初步确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。(4)YC2菌株降解黄曲霉毒素B1条件的研究。比较了pH、温度、培养时间和金属离子对YC2菌株降解活性的影响,结果表明:YC2菌株从鱼肠中分离出的YC2菌株对黄曲霉毒素B1的降解反应最佳条件为:pH 7,温度为35℃左右,培养时间为72h,不添加金属离子。(5)通过测定发酵上清液、胞内液等对AFB1的将降解能力,发现上清液降解AFB1的能力最高,为82.6%。由此判断该菌株分泌了一种胞外物对黄曲霉毒素B1进行降解。而上清液经热处理及蛋白酶K处理后,其AFB1降解率显著降低。因此,推测主要是YC2分泌的一种胞外蛋白酶起到了降解AFB1的作用。