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棉花黄萎病菌根据引起的症状类型和分子生物学特点,可以分为落叶型黄萎病菌和非落叶型黄萎病菌,落叶型黄萎病菌造成的危害远远大于非落叶型黄萎病菌,建立一套不经对病原物进行分离培养就能快速检测土壤、植株和种子内棉花黄萎病菌致病类型的方法,对于棉花黄萎病菌的检测、诊断、检疫、抗病育种及品种合理布局都具有十分重要的意义。本文用试剂盒对土壤、植株及种子的总DNA进行提取,用落叶型特异性引物DB19/DB22、DB19/espdef01和非落叶型特异性引物NDf/NDR、InND2f/InND2r,通过巢式PCR扩增建立起了一套棉花黄萎病菌的快速检测技术,可以对土壤、植株、种子内的黄萎病菌及其致病类型进行快速检测,并具有高度的准确性和特异性。土壤检测查明,用Soil DNA Isolation kit (MO BIO Laboratories,Inc生产)对带菌土壤总DNA进行提取,用上述引物可准确地检测出土壤中的黄萎病菌及其致病类型,对落叶型土壤检测下限为土壤中菌量密度为103个孢子/克,对非落叶型土壤检测下限为土壤中菌量密度为104个孢子/克。当带菌土样经过7天的保湿培养后进行检测,无论对落叶型土壤还是非落叶型土壤,都可以检测出黄萎病菌,这是因为潮湿土壤有利该菌的繁殖所致。用DNeasy plant Mini Kit (QIAGEN)对感病植株的总DNA进行提取,用以上引物进行巢式PCR扩增,不仅可以准确地鉴定发病植株内黄萎病菌及其致病类型,同时还可准确检测显症前植株体内黄萎病菌及其致病类型。通过对发病前不同时期棉花根、茎、叶进行检测表明,在棉花叶片显症前5-10天,可以从根和茎中检测到落叶型黄萎病菌,在棉花叶片显症前10-15天可以检测到非落叶型黄萎病菌,并可检测病菌在植株体内存在的位置。对种子的检测表明,用DNeasy plant Mini Kit (QIAGEN)试剂盒对种子总DNA进行提取后,通过该技术可以检测出1粒以上带病棉种内黄萎病菌的致病类型,通过对种子不同部位的检测发现,在短绒和种壳中都可以检测到黄萎病菌的存在,并可鉴定出其致病类型,但从胚乳中没有检测出黄萎病菌的存在。采用此法对南北疆各植棉团场采集送检的病株和重病田病土进行检测查明,在成功检测的128个病株样中,落叶型菌株33个,非落叶型菌株95个,它们分别占供测样品的25.8%和74.2%；在成功检测的192份重病田的病土中,落叶型菌株57个,非落叶型菌株135个,落叶型和非落叶型菌株分别占供测样品的29.7%和70.3%。两者所占比例基本吻合。可见落叶型菌株已在新疆棉区广泛存在,并在迅速扩展,特别是有些师团,已相当严重,这是十分值得重视的。今后我们应加强检疫,防止病区扩大,特别是落叶型病区种子的扩散,并做好病区不同抗性品种的合理布局。