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Narciclasine (NCS)是从水仙(Narcissus tazetta L)鳞茎分泌物中提取的一种生物活性物质,能够诱导人类癌细胞凋亡,目前在动物中被广泛的用作抗癌药物。已有的研究表明NCS不但能够剂量依赖性的抑制植物种子萌发和幼苗生长,还能够抑制乙醛酸循环体、过氧化物酶体和叶绿体的发育。本实验以烟草(Nicotiana tabacum cv. Willow leaf)愈伤组织和烟草悬浮细胞(Tobacco Bright Yellow-2, TBY-2)为材料,研究了天然活性产物NCS在植物中可能的作用机制。主要结果总结如下:(1)NCS对烟草愈伤组织生长量的抑制具有时间和浓度依赖性:0.1μM NCS对烟草愈伤组织的生长基本上没有影响,而当NCS的浓度达到2.5μM时,处理组愈伤组织的鲜重只有对照组的18%。此外,我们还检测了NCS对烟草愈伤组织的损伤状况,结果表明从处理的第12天起,1.0μM和2.5μM NCS就开始对愈伤组织有损伤,当处理时间延长到18天时损伤变得非常明显。最后我们重点研究了NCS对烟草愈伤组织呼吸代谢的影响,结果表明1.0μM和2.5μM NCS能够显著地诱导烟草愈伤组织的交替途径并且激活磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway, PPP)关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的活性,另一方面1.0μM和2.5μM NCS都明显抑制了烟草愈伤组织的细胞色素途径、三羧酸(Tricarboxylic acid, TCA)循环途径和糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnas pathway, EMP)。鉴于交替途径能够降低细胞的活性氧(Reactive oxygen species, ROS),而PPP能够提供烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸递氢体(NADPH)以及碳骨架,我们认为在NCS处理烟草愈伤组织的过程中,PPP和交替途径协同作用,共同调解细胞的氧化还原状态以及底物代谢,使得细胞在低耗能的情况下维持缓慢生长。(2)NCS对TBY-2细胞生长量的抑制以及死亡的诱导具有浓度和时间依赖性,2.5μM NCS不但能完全抑制TBY-2细胞的生长,还能够有效的诱导TBY-2死亡。当用2.5μM NCS处理细胞120 h时,处理组细胞100%死亡;而在对照中TBY-2细胞的死亡率一直维持在5%以内。通过细胞形态学实验以及生物化学实验发现NCS诱导的死亡具有典型的凋亡特征,如细胞胞质收缩,并且发生明显的质壁分离;细胞核中核仁消失,染色质凝集成颗粒状并沿着核膜分布;DNA降解成梯度条带,呈现"DNA ladder"状态。这表明NCS诱导TBY-2细胞发生的死亡是PCD,而不是坏死。为了进一步了解NCS诱导PCD的信号途径,我们分析了ROS的产生以及线粒体功能的改变。结果显示,在NCS诱导的PCD过程中出现了双峰状态氧爆发,即过氧化氢(H2o2)的浓度分别在NCS处理1h和12 h时出现了两个峰值。通过检测硫代巴比妥酸反应物TBARS含量和电导率,发现H202的累积出现在细胞质膜受损之前。这说明H2o2的累积不是PCD的损伤结果,它在NCS诱导的PCD过程中主要承担着信号分子的作用。线粒体的跨膜电位(MTP)和细胞呼吸速率的变化趋势基本一致,两者在处理的最初阶段都有一个轻微地约为10%的上升,之后迅速下降。当用ROS的清除剂过氧化氢酶(CAT)和N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)预处理细胞后,不仅降低了细胞内的ROS水平,还明显的抑制了线粒体膜电位下降,有效的减轻了细胞的程序性死亡。另外一方面,当向NCS处理组中添加外源H2o2时,细胞MTP下降地非常明显,细胞的死亡加速。这些数据表明细胞的氧化还原状态能够调控线粒体的功能活性,而线粒体的功能失调则诱导了细胞PCD的产生。综上所述,NCS能够诱导TBY-2发生程序性死亡,ROS累积和线粒体功能失调在这一过程中发挥了重要的作用。