论文部分内容阅读
木薯（Manihot esculenta Crantz,Cassava）是热带地区重要的粮食作物。土壤盐渍化、干旱、冷、热等是影响植物生长发育的重要限制因子,环境中的盐分是影响大部分农作物产量下降的主要因素之一。mRNA前体的选择性剪切是植物体内重要的非生物胁迫响应机制,植物体内有超过60%的内含子保留基因发生选择性剪切,影响植物的发育、生理、新陈代谢和环境应答,进而影响植物表型。富含丝氨酸/精氨酸（Serine/arginine,SR）的蛋白质是调节选择性剪接的关键组分,植物SR蛋白的表达在多个水平上受到胁迫调节,环境信号控制着它们的选择性剪切模式,磷酸化状态和亚细胞分布。本研究基于已完成测序的木薯基因组数据库,利用Blast等程序鉴定到一系列可编码木薯SR蛋白的18个基因,并在模式植物拟南芥中过表达进而研究其响应盐胁迫的功能。（1）以木薯RNA为材料,利用Gateway体系克隆18个MeSRs基因,并转入到pGWB514植物表达载体中。转化农杆菌后,用花序侵染法将含有目的基因的农杆菌转化到拟南芥中,通过抗生素筛选得到纯合单拷贝转基因株系。除MeSR34b基因无转基因纯合株系外,其余的17个MeSRs基因的转基因株系均有纯合株系。（2）用MEGA程序构建系统发生树,并对MeSR34的部分生物学功能进行了初探,通过氨基酸序列多重比对,按照植物SR蛋白的结构特性和同源性,木薯MeSR34蛋白归入SR蛋白的六大亚家族中的SR亚家族,并进行了蛋白理化性质分析。结果表明,MeSR34富含带正电荷的Arg残基,为亲水的碱性蛋白。对基因启动子区包含的顺式作用元件的分析预测表明,其特异性元件主要包括光应答元件、各种激素应答元件、胁迫应答元件等,初步表明木薯MeSR34可能参与响应逆境胁迫。（3）进一步研究MeSR34基因响应逆境胁迫的功能,研究表明苗期在125 mM NaCl处理条件下,过量表达MeSR34提高了转基因植株对盐胁迫的耐受性。此外,MeSR34转基因植株的萌发率比野生型高,根长和鲜重也都显著高于野生型。（4）为进一步解析MeSR34基因参与响应盐胁迫的功能,检测了野生型和MeSR34转基因植株的过氧化氢酶（catalase,CAT）活性、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、脯氨酸（Proline,Pro）含量和过氧化物酶（peroxidase,POD）活性及双氧水（hydrogen peroxide,H2O2）的含量。发现转基因株系的CAT活性、SOD活性、Pro含量和POD活性都比野生型高,双氧水含量比野生型低。表明在盐胁迫下MeSR34的过表达能增加转基因植株中CAT酶活并降低H2O2的含量,转基因植株可减少氧化损伤,增强抗氧化酶活性,提高盐胁迫的耐受性。（5）通过实时荧光定量PCR,发现200 mM NaCl处理7天时,两个过表达株系中AtCBL5（Calcineurin B-like）、AtCBL10和AtCIPK8（CBL interacting protein kinases）的表达量都显著低于野生型,而AtSOS1（salt overly sensitive）的表达量显著高于野生型。