硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是高硫酸化结构的线型阴离子多糖,可以通过共价连接于核心蛋白上,组成位于细胞膜表面和细胞基底膜的HS蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)。尽管已有研究表明HSPGs可以与骨折愈合相关的生长因子结合,直接介入生长因子信号转导和骨细胞功能的调节,但目前HS成骨作用的构效关系和机制尚未明确,且HS应用于3D打印的多孔复合支架的研究亦未见报道。为此,本论文通过分离纯化制备了HS,进一步选择性去硫酸化制备了系列衍生物,通过体外实验对其成骨活性、构效关系及相关通路进行了研究,并通过3D打印技术制备新型支架材料用于骨缺损修复的治疗。主要结果如下:(1)通过离子交换色谱技术,从粗品肝素钠中分离和纯化了硫酸乙酰肝素。经过验证其分子量为16.52 k Da,分散度为1.56。采用电导滴定计算HS硫酸根与羧酸根摩尔比为1.35。其次,通过化学修饰法对原料粗品肝素钠进行选择性去硫酸修饰,得到三种选择性去硫酸化肝素,即2-O-DS、6-O-DS和N-DS,分子量分别为87.68 k Da、33.93k Da和9.61 k Da。~1H-NMR图谱与标准品一致。(2)成骨增殖方面,HS/DS均具有一定的抑制成骨细胞增殖的作用,并且6-O-DS与N-DS对成骨细胞增殖能力的抑制作用稍强于2-O-DS与HS。HS/DS干预72小时后,成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性与对照组相比有明显的升高,其中HS组较其余去硫酸肝素组ALP的活性更高。ALP活性的升高表明HS/DS在促成骨分化方面有的积极作用,其中HS能够更为明显的促进成骨细胞的分化,作用的适宜浓度为50μg/m L。(3)采用计算机模拟对接的方法和表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术进行了虚拟和现实结合力的分析,表明HS可以与雌激素受体β(estrogen receptor-β,ER-β)紧密结合。随后,构建短干扰RNA(short interfering RNAs,si RNAs)下调MC3T3-E1成骨细胞的ER-β蛋白表达水平,并对转染和未转染的成骨细胞进行特定浓度的HS处理。结果表明,ER-β是调控RANKL表达的关键生物标志物,对破骨细胞的生成有一定作用。HS可作为ER-β介导的破骨细胞生成抑制的功能成分,通过影响RANKL/RANK/OPG通路,在调节骨量中起着生理作用,且这种作用很可能通过HS与ER-β的直接结合产生。(4)采用3D打印技术制备的聚己内酯-羟基磷灰石(Polycaprolactone-Hydroxylapatite,PCL-HA)支架具有良好的孔隙率和较高的生物相容性,保证了支架骨界面的稳定生物愈合。此外,所制备的支架具有较高的抗压强度和良好的延展性,能够满足不同骨缺损修复要求。在体外研究中,低浓度HS的PCL-HA支架在促进成骨细胞成熟和促进骨缺损修复方面效果最好;高浓度HS的PCL-HA支架对体外成骨细胞增殖有抑制作用,但在动物体内这种作用不明显。动物实验结果表明,各组支架均未显示出明显的生物毒性,且可以与骨组织形成紧密的生物结合。PCL-HA支架较空白组有一定的促进骨缺损修复作用,负载了两种不同浓度HS的支架促进骨缺损修复的作用均明显高于单纯PCL-HA支架,但两种浓度HS支架间的差异不显著。