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“金蒲”灌注剂是本实验室研制的一种治疗奶牛乳房炎的纯中药制剂,咖啡酸是该方剂中的一种主要活性成分,本文通过研究咖啡酸抗脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)的炎性损伤作用及其分子机制,为该方剂的临床应用提供理论依据和技术支持。本研究通过MTT法检测LPS对bMEC细胞活力的影响,并筛选了LPS诱导bMEC损伤模型条件；利用扫描、透射电镜观察bMEC超微结构变化和流式细胞术检测bMEC的凋亡情况对损伤模型进行了评价；通过深度测序技术分析LPS诱导的bMEC基因表达谱变化,筛选差异基因并对其进行多重分析,预测了LPS诱导的bMEC损伤分子机制；利用Western Blot及RT-PCR技术对相关炎症信号通路中关键蛋白和炎性因子的表达进行了验证；并探讨了咖啡酸抗LPS诱导的bMEC结构损伤的分子机制。相关研究结果如下：不同浓度的LPS(10、50、100、200μg/mL)作用bMEC不同时间(3、6、12、18h)后,结果显示,LPS能够显著地降低bMEC的细胞活力,这种作用具有明显的时间、剂量依赖性。选择50μg/mL的LPS作用bMEC12h作为损伤模型条件。扫描电镜观察显示：模型组细胞界限不清,细胞明显固缩,细胞表面微绒毛排列紊乱或缺失,细胞出现不同程度塌陷；透射电镜观察显示：模型组细胞游离面微绒毛肿胀或断裂,细胞核空化,内质网极度扩张,线粒体结构模糊,细胞质基质结构疏松；流式细胞术检测结果显示：模型组细胞的细胞凋亡率明显升高,尤其是早期细胞凋亡率。说明LPS能够破坏bMEC的细胞形态结构。咖啡酸(10、25、50μg/mL)显著地降低了LPS诱导的bMEC细胞活力下降,明显减弱了LPS诱导的细胞形态结构损伤,显著降低了LPS诱导的细胞凋亡率,咖啡酸的功效具有明显剂量依赖性。基因转录组深度测序分析结果显示,模型组与对照组细胞共有1435个差异基因,其中上调基因1301个,下调基因134个。GO分析得出,差异基因主要富集于与细胞应激应答、信号转导、物质代谢、生长分化等生物进程,说明LPS对bMEC的生理功能产生了较大的影响。KEGG Pathway分析发现,多个差异基因富集于NF-κB、MAPKs信号转导通路中,因此初步阐明LPS通过激活bMEC的NF-κB、MAPKs信号通路,诱导大量的炎性介质释放,导致了bMEC的炎性损伤。咖啡酸(10、25、50μg/mL)通过减少IκBa的降解和降低p65的磷酸化水平,抑制了bMEC的NF-κB的活性；通过降低p38、JNK、ERK1/2的磷酸化水平,抑制了细胞MAPKs信号通路的转导,从而减少了LPS诱导的bMEC的IL-8、IL-1β、IL-6和TNF-a的表达,减弱了LPS诱导的bMEC炎性损伤作用。