近年来，越来越多的β-半乳糖苷酶被用来合成低聚寡糖、天然糖苷、药物前体等。然而，β-半乳糖苷酶在催化这些反应时也暴露出了一些缺陷:水解产物（葡萄糖、半乳糖）抑制其酶活、合成天然糖苷时芳香醇类容易导致酶失活、修饰药物时对多功能团的选择性低或多糖基化而导致产物复杂等，这些不足限制了β-半乳糖苷酶更广泛的应用。非水相催化在改变反应平衡、调控产物等方面具有非常突出的优势，然而，耐有机溶剂β-半乳糖苷酶研究比较少。本论文成功筛选获得一种耐有机溶剂的新型β-半乳糖苷酶且呈现了很高的转糖基活性;通过载体和宿主的筛选实现了其在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达，并对其性质进行了研究;通过添加亲水性有机溶剂成功缓解了芳香醇引起的酶失活，实现了天然糖苷的克级制备;并利用亲水性有机溶剂实现了核昔类药物糖基化产物的调控。　　内容摘要如下:　　1.新型β-半乳糖苷酶的筛选:用含有X-gal的平板从本课题组耐有机溶剂菌库中快速筛选出约300株β-半乳糖苷酶产生菌，再以酪醇和叠氮胸苷作为模式底物进行转糖基活性的复筛，其中菌株YZ08所产β-半乳糖苷酶对芳香醇和核苷类化合物显示出非常高的转糖基活性，该菌鉴定为Bacillus megaterium，命名为Bacillus megaterium YZ08。成功从菌株YZ08中克隆出β-半乳糖苷酶基因（bmg），全长3105bp，编码1034个氨基酸。　　2.Bacillus megaterium YZ08来源的β-半乳糖苷酶(BMG)的高效分泌表达:本研究首先实现了BMG在大肠杆菌中的胞内表达，并通过镍柱一步纯化获得纯的BMG，比酶活为7.38 U/mg。本研究进一步选用大肠-枯草穿梭质粒pMA5，WapA信号肽，构建重组表达载体pMA5-bmg，得到重组菌B.subtilisWB800/pMA5-bmg，实现了细菌来源的β-半乳糖苷酶的胞外分泌表达，酶活达17550 U/L。通过硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose FF弱阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱等步骤实现了重组BMG的分离纯化，比活力为228.61 U/mg，是大肠杆菌表达的30倍左右。酶学性质研究表明:BMG最适pH在7.5左右，在pH6-9范围内有很好的稳定性;BMG对温度比较敏感，在30℃以上不稳定;BMG在几种常用的亲水性有机溶剂中(20％，v/v)表现出良好的耐受性，且在亲水性有机溶剂中稳定性显著提高。　　3.报道了一种新型Na+/K+-别构激活的β-半乳糖苷酶。BMG对Na+和K+有绝对的依赖性，圆二色谱分析表明:添加1 mMNa+和K+可显著改变BMG的构象。Mg2+能显著增强BMG的热稳定性以及在DMSO、DMF、甲醇、丙酮等亲水性有机溶剂中的稳定性，其中在30％ DMSO体系中其半衰期可提高35倍左右;BMG在不同条件下的二级结构含量分析表明，Mg2+能够维持BMG的二级结构，使酶分子更加稳定。　　4.首次报道了一种没有葡萄糖和半乳糖抑制的β-半乳糖昔酶。葡萄糖和半乳糖不仅对BMG水解活力和转糖基活力没有抑制，而且还有一定的激活作用。动力学参数研究表明葡萄糖和半乳糖的添加导致Km值和Vmax值变大，推测葡萄糖或半乳糖可能与BMG发生了诱导契合作用。　　5.建立了一种新的提高BMG对芳香醇的耐受性的方法。通过添加亲水性有机溶剂，BMG在200 mM香草醇溶液中的半衰期提高了9-123倍。亲水性有机溶剂的添加有效地保护了BMG免受芳香醇分子的破坏。在30％DMSO体系中，以香草醇、4-羟基苯甲醇、3-羟基苯甲醇、2-羟基苯甲醇、肉桂醇、4-甲氧基苯甲醇、4-甲氧基苯乙醇为底物成功合成了一系列糖苷天然产物，底物浓度达到了300-400 mM，成功实现了多种天然糖苷及其衍生物的克级制备。　　6.实现了多种核苷类化合物的糖基化修饰与产物调控。BMG能以乳糖为供体，催化叠氮胸苷、肌苷、尿苷、阿糖尿苷、5-氟-2'-脱氧尿苷、2'，3'-二脱氧胸苷、5-甲基-2'-脱氧尿苷、2'-脱氧尿苷等核苷类化合物的糖基化反应。通过添加亲水性有机溶剂成功实现了多种核苷类化合物糖基化产物由复杂到单一的转变。10％DMSO还显著提高了BMG对底物的亲和力，催化效率增加了1倍。