伪狂犬病毒（Pseudorabies viurs,PRV）又称猪疱疹病毒1型（Suid herpesvirus1）,属疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科,猪是其易感动物,可引起猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）。疫苗免疫是防控该病最为有效的方法,但2011年以来国内许多猪场在使用疫苗后仍然爆发了伪狂犬病疫情。多位学者研究表明,现有PRV疫苗已不能对流行毒株的感染提供完全保护,因此有必要研究针对流行毒株的新疫苗。本研究拟以rPRV-AH-gI^-/gE^-/EGFP⁺株为亲本毒,利用同源重组技术在缺失gI、gE基因的部位插入PRV gC基因表达盒,构建双表达gC基因同时缺失gI、gE基因的重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺,在此基础上研究该病毒的生物学特性及免疫原性。主要研究如下:1.重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺的构建以PRV AH-China-2013（简称PRV-AH）gC基因编码区替换pEGFP-N1质粒中EGFP编码序列,通过PCR扩增获得P_CMV-gC-SV40 polyA表达盒,将其插入pMD-LA-RA质粒中构建重组转移质粒pMD-LA-gC-RA。将该质粒转染至BHK-21细胞,然后接种rPRV-AH-gI^-/gE^-/EGFP⁺,使质粒和病毒基因组在细胞内发生同源重组,通过单细胞分离与空斑纯化获得重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺。通过PCR检测及荧光观察证实重组到病毒中已成功插入gC基因表达盒,且去除EGFP标记基因。2.重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺的生物学特性研究绘制PRV-AH、rPRV-AH-gI^-/gE^-/EGFP⁺和rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺三种病毒的一步生长曲线,表明这三种病毒有相似的生长动力学,其中三种病毒最高滴度分别为10^-7.63 TCID₅₀/mL、10^-7.00 TCID₅₀/mL和10^-7.38TCID₅₀/mL。通过q RT-PCR检测重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-和rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺的gC基因在mRNA转录水平上的差异,结果显示在接毒后第6 h重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺的gC mRNA含量是rPRV-AH-gI^-/gE^-株的1.85倍,第12 h是35.93倍,第24 h是40.64倍。3.重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺的免疫效力及攻毒保护效果评价采用100μL的10⁵ TCID₅₀/100μL、10⁶ TCID₅₀/100μLrPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺灭活疫苗分别对小鼠进行两次免疫,间隔28 d,于免疫后不同时间采血测定中和抗体水平。二免后28 d用致死剂量的PRV经典毒株和PRV AH株进行攻毒。结果表明10⁶ TCID₅₀/100μL免疫组对两种PRV强毒的攻击都能100%保护;10⁵TCID₅₀/100μL免疫组对致死量的PRV AH株攻击具有100%保护率,对PRV经典毒株有87.50%的保护率。本研究成功构建了双表达gC基因同时缺失gI、gE基因的重组病毒rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺,且与rPRV-AH-gI^-/gE^-相比,gC基因mRNA转录水平显著提高。动物实验结果表明,rPRV-AH-gI^-/gE^-/gC⁺具有良好的免疫原性,且对PRV经典毒株和流行毒株均有良好的免疫保护效果,有望作为一种新的疫苗候选株用于控制当前国内伪狂犬病疫情。