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目的:应用RNAi技术,构建转录因子GATA4、NKX2-5慢病毒RNAi载体并鉴定,旨在研究先天性心脏病致病基因GATA4、NKX2-5体外表达模式。利用CRISPR/Cas9技术构建先天性心脏病关键基因GATA4、TBX5和NKX2-5的表达载体,为后续基因编辑工作奠定前期分子实验基础。方法:1)RNAi技术。首先用BsmBI（Esp3I）限制性内切酶对慢性病毒载体lenti CRISPRv2进行酶切,并通过胶回收获得线性化载体。利用T4连接酶将处理后的双链sg RNA和载体进行连接,通过大肠杆菌转化、菌落PCR鉴定、质粒提取和测序最终获得lenti CRISPRv2-NKX2-5、lenti CRISPRv2-GATA4两种病毒表达载体。设计2条NKX2-5、GATA4基因siRNA干扰序列,与限制性内切酶Bsm B I后的p MGic7.1载体连接。载体构建成功后,将包含NKX2-5 siRNAs干扰序列慢病毒载体转染HUVEC细胞,包含GATA4 siRNAs慢病毒载体转染293T细胞。NKX2-5基因随机分为实验组、阴性对照组,GATA4基因随机分为实验组、阴性对照组及空白对照组。并通过Western bloting法检测NKX2-5、GATA4蛋白表达,以及q RT-PCR检测NKX2-5、GATA4基因表达,以确定GATA4与NKX2-5基因沉默水平。3)CRISPR/Cas9技术。利用NCBI数据库获取调控先天性心脏病关键基因NKX2-5、GATA4、TBX5的基因序列,随后通过生物软件在线设计出3个基因对应的sg RNA。对慢性病毒载体lenti CRISPRv2进行Bsm B I单酶切,通过胶回收获得线性化载体。利用T4连接酶将处理后的双链sg RNA和载体进行连接,通过大肠杆菌转化、质粒提取和测序最终得到lenti CRISPRv2-NKX2-5、lenti CRISPRv2-GATA4、lenti CRISPRv2-TBX5三种病毒表达载体。结果:1)RNAi技术NKX2-5基因siRNA干扰序列为CCGGGCCTCAATC CCTACGGTTATACTCGAGTATAACCGTAGGGATTGAGGCTTTTTTG。慢病毒载体在5μg/m L Polybrene条件下阳性细胞比例基本达到高峰,转染效率可达80%以上。Western blot结果显示,实验组PLVE264蛋白水平低于对照组PLVT7。qPCR结果观察到,实验组PLVE2641靶基因NKX2-5表达量显著下降,抑制率>72%（P<0.05）,表明NKX2-5基因被有效沉默。GATA4基因p MGic7.1载体可与1条siRNA干扰序列正确连接,基因序列如下:CGAAACACCGGGGACATAAT CACTGCGTAATCCTCGAGGATTACGCAGTGATTATGTCCTTTTTTGAATTCG GA,符合实验要求。空白对照组在45 k Da处可见蛋白条带;实验组GATA4蛋白相对表达量为0.739±0.056,阴性对照组为0.997±0.001,两组比较P<0.05。实验组GATA4 m RNA相对表达量为0.362±0.024,阴性对照组为0.998±0.001,空白对照组为0.812±0.001,实验组GATA4 m RNA相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组（P均<0.05）。2)CRISPR/Cas9技术。获得评分最高且碱基数量合适的sg RNA,通过对表达载体的线性化酶切,成功去除载体中2000bp左右的置换片段,对连接后的载体进行测序显示双链sg RNA与病毒表达载体置换片段序列一致。结论:通过成功构建NKX2-5、GATA4基因RNAi慢病毒载体并分别转染HUVEC与293T细胞,促使NKX2-5、GATA4基因的表达在转染细胞中被有效抑制,这为进一步研究CHD形成奠定实验基础;利用CRISPR/Cas9成功构建先心病关键基因NKX2-5、GATA4、TBX5表达载体,为基因治疗提供理论依据。