论文部分内容阅读
第一部分大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定目的:体外对大鼠来源的骨髓间充质干细胞进行分离、培养和鉴定,为骨髓来源的间充质干细胞在肿瘤微环境中的安全应用做好前期研究准备。方法:1.通过差速贴壁法对大鼠骨髓间充质干细胞进行分离培养。观察细胞生长情况,细胞贴壁生长铺满瓶底约80%时,按照2:1比例进行传代,保存P3-P4代细胞用于后续实验。2.大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定:采用流式细胞术检测P3代细胞表面间充质干细胞标记物(CD34、CD90、CD45、CD71)及免疫荧光检测P3代细胞表面间充质干细胞标记物(CD34、CD90、CD105)表达情况。茜素红染色鉴定成骨分化潜能,油红O鉴定成脂分化潜能。结果:1.倒置显微镜下形态:细胞生长均匀,形态呈纺锤体样,连续传代无明显形态变化、细胞自身无衰老趋势。2.间接免疫荧光结果显示,原代细胞表达CD90和CD105,不表达CD34。流式检测结果显示,细胞表面抗原CD71、CD90、CD34、CD45表达率分别是94.0%、100.0%、7.2%、4.7%,达到MSCs细胞表面抗原要求,可以进行后续实验。成骨、成脂诱导分别能观察到铁锈红色结节和红染脂滴。结论:大鼠骨髓间充质干细胞能通过差速贴壁培养法进行分离、可培养出纯度高且具有多向分化潜能的细胞。第二部分肿瘤微环境中IL-22通过IL22RA1/STAT3通路促进MSCs恶性转变目的:探索C6胶质瘤微环境中IL-22通过IL22RA1/STAT3通路诱导大鼠骨髓间充质干细胞恶性转化过程中的作用机制。方法:1.通过transwell小室,对C6胶质瘤细胞与大鼠骨髓间充质干细胞进行间接共培养,构建体外C6胶质瘤微环境。2.以正常大鼠骨髓间充质干细胞为对照,检测与C6胶质瘤细胞间接共培养后细胞形态、细胞周期、增殖、侵袭及迁移能力的变化;使用ELISA检测培养上清液中IL-22的表达;实验荧光定量PCR及Western blot检测瘤化后大鼠骨髓间充质干细胞IL22RA1的表达;同时采用生物信息学对神经胶质瘤及正常细胞中IL-22及IL22RA1的表达情况。3.骨髓间充质干细胞培养液中添加外源性IL-22(20ng/ml),培养24和48小时后检测细胞增殖、侵袭及迁移能力的变化;同时检测此时MSCs中STAT3及p-STAT3变化;4.转染si-STAT3抑制STAT3表达,观察经IL-22诱导后MSCs的细胞增殖、侵袭及迁移能力的变化。结果:1.与C6胶质瘤细胞间接共培养1个月后的MSCs,形态发生显著变化,呈现神经胶质瘤细胞样改变,胞质向核收缩,变细变长,胞核变小,细胞排列紧密,核质比增大。2.与C6胶质瘤细胞共培养后MSCs增殖能力显著增高,且G2/S期比例较单独MSCs培养组显著增高;同时与C6胶质瘤细胞共培养后的MSCs侵袭和迁移能力均显著增加,提示与C6胶质瘤干细胞共培养后MSCs具有恶性转变的倾向。3.利用UCSC分析了IL-22和IL22RA1在TCGA-GBM中的表达谱癌症基因组浏览器,发现原发性和复发性胶质母细胞瘤的IL22RA1表达较正常组织增加,而IL-22在胶质母细胞瘤和正常组织中的表达较低。4.ELISA检测发现C6胶质瘤细胞及间充质干细胞上清液中均无IL-22表达;与C6胶质瘤细胞共培养后的MSCs中IL22RA1的m RNA及蛋白表达均显著增加。5.在IL-22作用第24h和48h后,MSCs细胞活力较MSCs单独培养组均显著增高;Bcl-xl表达均显著增高;MSCs侵袭和迁移能力均显著增加。6.IL-22能够显著增加STAT3和p-STAT3的表达水平,同时上调磷酸化和非磷酸化蛋白的比例;干扰STAT3后可显著降低经IL-22处理后的MSCs的增殖、侵袭及迁移能力。结论:C6胶质瘤微环境中除肿瘤细胞本身通过旁分泌功能诱导骨髓间充质干细胞恶性转变,肿瘤微环境中的免疫细胞也可通过分泌IL-22等炎症因子通过STAT3通路诱导骨髓间充质干细胞恶性转变。第三部分肿瘤微环境中Lnc RNA MEG3通过STAT3通路抑制MSCs恶性转变目的:探索上调lnc RNA MEG通过STAT3/m TOR通路抑制C6胶质瘤微环境中骨髓间充质干细胞恶性转变的机制。方法:1.采用实时荧光定量PCR检测与C6胶质瘤细胞共培养前后大鼠骨髓间充质干细胞中lnc RNA MEG3、lnc RNA H19、lnc RNA TUG1、lnc RNA PVT1、lnc RNA XIST、lnc RNA HOTAIRM1的表达变化。2.利用生物信息学对lnc RNA MEG3在神经系统肿瘤中的表达进行分析。3.通过体内外分别检测MEG3对瘤化后大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响:体外实验:采用细胞周期检测MEG3对细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术检测MEG3对细胞凋亡的影响;采用Transwel实验检测MEG对细胞侵袭和迁移能力的影响。体内实验:建立裸鼠皮下成瘤生长模型,观察MEG3对瘤化后大鼠骨髓间充质干细胞体内成瘤的影响。4.MEG3通过调控STAT3活性对抑制MSCs瘤化的机制研究:通过荧光定量PCR检测转染lnc RNA MEG3后瘤化后的MSCs中STAT3的表达情况,通过Western blot及免疫荧光检测STAT3及p-STAT3水平;结果:1.Realtime PCR检测发现与C6胶质瘤细胞共培养后的MSCs中lnc RNA MEG3表达显著降低;利用SAGE及Oncomine分析了lnc RNAs在神经系统肿瘤中的表达,发现在神经系统肿瘤中lnc RNA MEG3表达较正常组织均显著降低,其中在神经胶质细胞瘤中表达降低尤为显著。2.瘤化后大鼠骨髓间充质干细胞中转染MEG3慢病毒组,凋亡细胞数和坏死细胞数呈上升趋势,增殖、侵袭及迁移能力均显著减低,过表达MEG3的MSCs在裸鼠皮下没有形成肿瘤的重量和体积明显减小及预后得到明显改善。3.转染MEG3慢病毒组,瘤化后的MSCs中STAT3 m RNA及蛋白表达均显著降低。结论:肿瘤微环境中MSCs发生恶性转变与lnc RNA MEG3表达降低有关;MEG3能够通过抑制STAT3通路抑制肿瘤微环境中大鼠骨髓间充质干细胞发生恶性转变。第四部分肿瘤微环境中STAT3通过m TOR通路抑制细胞自噬介导MSCs恶性转变目的:探索肿瘤微环境中活化后是STAT3是否通过m TOR通路抑制大鼠骨髓间充质干细胞自噬介导其发生恶性转变。方法:1.通过Western blot及免疫荧光观察大鼠骨髓间充质干细胞瘤化前后自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、P62及m TOR的表达变化;通过电镜观察瘤化前后MSCs中自噬小体数量的变化,综合判断大鼠骨髓间充质干细胞瘤化前后自噬性况的变化。2.通过si-STAT3干预STAT3表达,采用Western blot及免疫荧光观察自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、P62及m TOR的表达变化;采用LC3双标腺病毒,用激光共聚观察干序STAT3表达后,瘤化后MSCs中自噬瘤的变化性况。3.通过m TOR抑制剂雷帕酶素,判断通过抑制m TOR途径恢复细胞自噬后,观察其对瘤化后MSCs增殖、侵袭、迁移及皮下成瘤的影响。结果:1.通过Western blot及免疫荧光法检测Beclin1、LC3B、P62及m TOR的表达,结果发现与C6胶质瘤共培养后的MSCs的LC3B-Ⅱ显著降低,瘤化后的MSCs自噬水平在显著降低。同时对Beclin1这一形成自噬体过程的重要蛋白做了检测,发现瘤化后的MSCs中Beclin1表达显著降低。与此同时自噬底物蛋白P62在瘤化后的MSCs中表达显著增高,同时自噬抑制蛋白m TOR表达也显著增高,进一步证实瘤化后的MSCs自噬水平显著降低。2.经电镜观察干细胞瘤化后,细胞内自噬体的数量显著减少。3.接受si-STAT3转染后的瘤化了的MSCs可促进由瘤化所导致的LC3表达抑制。与此同时,转si-STAT3后,瘤化后MSCs中m TOR及P62蛋白表达显著降低,而Beclin1表达显著增高;干扰STAT3后,细胞自噬体和自噬溶酶体均显著增高,表明干扰STAT3后,瘤化后的MSCs自噬水平得到恢复。4.通过加入m TOR抑制剂雷帕霉素后,细胞增殖、侵袭及及迁移能力均显著降低。结论:肿瘤微环境中活化后的STAT3主通过m TOR通路抑制大鼠骨髓间充质干细胞自噬介导其发生恶性转变。