随着水母爆发日益频繁与人类涉海活动的逐渐增多，有毒水母蜇伤已成为最常见的海洋生物伤，水母蜇伤患者可出现多种局部或全身症状。研究表明水母毒素是一类结构新颖的肽类，具有溶血、心血管、肝肾、神经和皮肤坏死等多种生物活性，其中溶血活性，即损伤红细胞的效应，是水母毒素中普遍存在的一类生物活性。水母种类不同，其毒素的溶血机制亦有所区别，目前关于水母毒素的溶血机制主要有孔道形成和酶活性两种假说。我们推测，水母在亿万年的进化过程中还可能形成其他“高效、直接”发挥毒性的方式，本文第一部分旨在探索孔道形成之外，脂质过氧化损伤在发形霞水母（Cyanea capillata）触手提取物（tentacle extract, TE）产生溶血过程中的作用。水母蜇伤患者可分三种情况：极少数中毒非常严重，出现急性心衰而快速死亡；大多数患者中毒较轻，以蜇伤部位皮肤炎症为主，只需局部处理；另有一部分患者中毒程度介于前两者之间，可出现迟发的多器官功能损伤而需要住院治疗。本课题组前期研究表明，中等剂量TE可以引起动物延迟性的多器官损伤，而肾脏（尤其是肾小管）的急性损伤可能是TE致大鼠延迟死亡的主要原因。因此本文第二部分重点研究TE对肾小管上皮细胞（NRK-52E）的损伤机制。受溶血机制研究结果的启发，TE对NRK-52E细胞的损伤按照“脂质过氧化—活性氧—线粒体—细胞凋亡”的思路来展开。方法第一部分：TE致红细胞损伤（溶血活性）机制研究首先，以0.45%红细胞悬液为受试对象检测TE溶血活性的剂量效应关系，并检测Ca²⁺和Ca²⁺通道阻断剂地尔硫卓、维拉帕米、硝苯地平对TE溶血活性的影响。利用共聚焦显微镜观察TE作用后红细胞内Ca²⁺浓度的变化，并观察Ca²⁺通道阻断剂地尔硫卓的干预效应。通过系列PEG渗透保护实验，研究孔道形成在TE溶血活性机制中的作用。将抗氧化剂预先与红细胞孵育，检测Vc和GSH对TE溶血活性的影响。通过检测TE作用后红细胞MDA水平，分析TE对红细胞的脂质过氧化损伤效应，并在整体动物中，检测抗氧化剂Vc对TE引起的体内溶血和电解质紊乱的影响。第二部分：TE致NRK-52E细胞损伤机制初探利用MTT法检测不同浓度TE不同作用时间对NRK-52E细胞活力的影响，并在显微镜下观察细胞形态学变化。采用Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪检测TE作用后细胞凋亡与坏死情况。利用荧光探针DCFH-DA标记技术观察TE作用后细胞内ROS水平，用TBA比色法检测细胞MDA水平，Rhodamine123染色检测线粒体膜电位的变化。结果第一部分：TE致红细胞损伤（溶血活性）机制研究TE对0.45%红细胞悬液产生的溶血效应具有剂量依赖性，产生50%溶血时TE浓度约为150μg/ml。Ca²⁺能增强TE的溶血活性，而三种Ca²⁺通道阻断剂均能不同程度抑制TE的溶血活性。TE作用后，红细胞内Ca²⁺明显升高，而Ca²⁺通道阻断剂地尔硫卓可以部分拮抗TE作用后红细胞内Ca²⁺升高的幅度。平均分子量超过4000的PEG可以抑制TE产生的溶血效应。TE作用后红细胞MDA水平随TE剂量依赖性升高，且抗氧化剂Vc和GSH均可以显著拮抗TE的溶血活性；在体内，Vc也可以降低TE引起的溶血程度以及血清中K+和Lac升高的幅度。第二部分：TE致NRK-52E细胞损伤机制初探TE对NRK-52E细胞活力的影响具有剂量和时间依赖性，TE作用后细胞形态发生改变，不再贴壁生长。随TE浓度增大，凋亡和坏死的细胞增多。TE作用后，NRK-52E细胞胞内ROS与MDA水平升高、线粒体膜电位降低。结论除了孔道形成之外，通过脂质过氧化损伤红细胞产生溶血也是TE可能的溶血机制；抗氧化剂Vc可以在体内和体外两个层面抑制TE的溶血活性，可以作为预防和治疗水母蜇伤的候选药物。通过损伤粒体，导致线粒体膜电位降低，胞内活性氧堆积，进而介导细胞凋亡与坏死是TE产生NRK-52E细胞毒性的机制之一。