背景:胃癌(gastric cancer,GC)是消化系统中常见的一种恶性肿瘤,有着很高的发病率和病死率,全球每年新发胃癌病例约100万例,严重威胁人体健康和生命质量。虽然现在我们在胃癌的临床治疗及基础研究方面取得了一些进步,但是多种因素参与胃癌的发生发展,其发病机制十分复杂,有许多问题仍有待阐明。找到有效调控胃癌发生发展的重要分子可以指导研发临床胃癌分子诊断及分子靶向药物,需要我们深入研究探讨。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200碱基的RNA分子,多数由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,RNAPⅡ)转录生成,不能编码蛋白,但是生物学功能非常复杂,可以调节转录、翻译、表观遗传修饰等多个层面。目前发现lncRNA参与多种疾病的发生发展,其对肿瘤的调控作用是当今研究的热点。研究发现lncRNA可调控包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌在内的多种肿瘤。目前随着基因高通量芯片的发明与应用,科学家们已经从宏观角度获取多种疾病的lncRNA差异表达差异谱。为后续功能及机制研究提供了坚实的基础。在肿瘤相关的lncRNA中,H19是目前研究的一个热点,其长度约为2.3kb,位于人染色体的11p15.5位置。科学家们最初在胚胎性肿瘤细胞中发现H19具有抑制肿瘤的特点的。但最近有的研究也显示H19具有促进肿瘤细胞生长、侵袭转移的作用。另外机制方面,研究发现H19可以在转录、翻译、表观遗传学等多个层面调控肿瘤相关基因的表达。但是,其对肿瘤的调控功能仍有争议,并且机制研究还不够深入完全,所以关于H19在胃癌中的具体功能以及其调控机制仍然有待我们深入研究。目的:1.筛选胃癌及癌旁组织中差异表达的lncRNA;2.预测lncRNA靶基因及其相关功能与机制;3.验证lnc-H19/miR-675在胃癌中的靶点;4.观察lnc-H19/miR-675对胃癌增殖及凋亡的影响;5.探讨lnc-H19/miR-675对靶基因及下游信号通路的调控机制。方法:1.随机选取6对胃癌组织及癌旁组织,提取RNA,进行标本质量验证;2.对质量验证通过的标本进行差异lncRNA的筛选;3.对预测靶基因进行GO分析、KEGG分析、转录因子(transcriptionfacter,TF)分析,探索潜在机制;4.利用数据库预测miR-675靶点基因;5.构建miR-675高表达分子miR-675 mimic和抑制miR-675表达的miR-675 inhibitor转染细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)及蛋白印记(Westernblot,WB)检测靶基因的表达量;6.构建H19质粒及小干扰RNA(siRNA)转染细胞,通过RT-PCR观察miR-675及靶基因的表达量;7.构建靶基因的野生型和突变型荧光素酶质粒,共转染H19质粒、H19 siRNA、miR-675mimic或inhibitor以及对照,检测荧光强度;8.用RT-PCR检测胃癌和癌旁组织样本H19、miR-675、靶基因的表达情况,另外用RT-PCR检测胃癌细胞、正常胃粘膜细胞等不同细胞系中H19、miR-675、靶基因的表达情况;9.转染H19质粒及siRNA,观察H19对胃癌细胞增殖及凋亡的影响,同时共转染miR-675inhibitor或mimic,观察miR-675对H19在胃癌中增殖凋亡调控作用的影响;10.转染miR-675mimic或inhibitor,观察miR-675对胃癌细胞增殖及凋亡的影响,同时共转染靶基因质粒或靶基因siRNA,观察靶基因对miR-675在胃癌中增殖凋亡调控作用的影响;11.构建裸鼠成瘤模型,皮下注射感染慢病毒LV-nc、LV-shH19、LV-shH19+LV-miR675的胃癌细胞,观察胃癌组织生长情况及28天处死后的肿瘤重量。12.通过WB探索H19/miR-675轴对靶基因及下游信号通路的影响。结果:1.通过对6对组织的质量验证,发现样本均一性、分布趋势均良好。2.通过lncRNA高通量芯片分析,发现共有1581个lncRNA在胃癌及对照组之间的表达具有统计学意义,其中有422个lncRNA表达上调,1159个lncRNA表达下调。3.通过GO分析、KEGG分析、转录因子分析,发现lncRNA预测的靶基因富集程度较高的包括有丝分裂细胞周期,说明差异lncRNA调控细胞生长,调节肿瘤发生发展。另外我们还发现种肿瘤中起重要调节作用的转录因子,如JUND、E2F1、SP1、MYC、IRF3,可能参多与lncRNA对肿瘤的调控机制。4.通过TargetScan数据库信息,我们预测FADD基因为miR-675的靶基因。5.调节细胞内miR-675的表达,发现FADD基因在RNA及蛋白水平均发生变化,且与miR-675表达情况相反。6.H19质粒及siRNA转染细胞后发现miR-675靶基因FADD的RNA及蛋白表达均下降;7.转染FADD含有与miR-675结合位点的野生型荧光素酶质粒,并且共转染H19 质粒、H19 siRNA、miR-675mimic 或 inhibitor 以及对照,发现 miR-675 和H19降低野生型荧光素酶荧光素强度;但是突变miR-675与FADD结合的碱基对后,miR-675和H19对突变型荧光素酶荧光素强度无影响。8.用RT-PCR检测胃癌和癌旁组织样本H19、miR-675、靶基因的表达情况,发现胃癌中H19、miR-675明显高表达,而FADD表达降低;另外用RT-PCR检测胃癌细胞、正常胃粘膜细胞等不同细胞系中H19、miR-675、靶基因的表达情况,发现和正常胃粘膜细胞相比,胃癌细胞中H19、miR-675明显高表达,FADD表达降低,同时我们发现胃癌耐顺铂细胞系中H19、miR-675明显高表达,FADD表达降低。9.转染H19质粒及siRNA,发现H19可以促进胃癌细胞增殖,抑制胃癌细胞凋亡,同时共转染miR-675inhibitor或mimic,发现H19的促增殖抑凋亡作用部分是通过miR-675实现的。10.转染miR-675mimic或inhibitor,发现miR-675可以促进胃癌细胞增殖及抑制胃癌细胞凋亡,同时共转染FADD质粒或靶基因siRNA,发现miR-675的促增殖抑凋亡作用部分是通过调节FADD实现的。11.构建裸鼠成瘤模型,观察胃癌组织生长情况发现感染LV-shH19的肿瘤细胞生长比感染LV-nc肿瘤细胞显著缓慢,LV-shH19与LV-miR675共转染后胃癌细胞生长能力部分增强;28天处死后小鼠取出肿瘤组织,发现。现感染LV-shH19的肿瘤组织比感染LV-nc肿瘤组织轻,LV-shH19与LV-miR675共转染后胃癌细胞重量增加。12.通过WB发现H19/miR-675轴可以调节靶基因FADD的表达,从而调控下游caspase通路来影响胃癌细胞凋亡及增殖。结论:1.我们的芯片发现胃癌中按照差异2倍以上、p值低于0.05标准筛选的差异表达的lncRNA高达1581条,并且和有丝细胞分裂、多个重要转录因子相关。2.FADD是H19/miR-675的作用调控靶点。3.H19/miR-675在体内外促进胃癌细胞生长,抑制胃癌细胞凋亡。4.H19/miR-675通过FADD调节Caspase信号通路,从而调节胃癌细胞生长。