论文部分内容阅读
第一部分亚低温对沙土鼠前脑缺血再灌注损伤神经元凋亡及其行为学的影响
目的:通过动态观察亚低温(33℃，4h)对沙土鼠前脑缺血再灌注后不同时间点行为学及海马TUNEL阳性细胞表达的影响，观察本实验条件下亚低温有无确切的神经元保护作用。
方法:采用沙土鼠双侧颈总动脉阻断5min前脑缺血再灌注损伤模型，随机分为假手术组(SH)，常温再灌注组(IR)，亚低温假手术组(HSH)，亚低温再灌注组(HIR)。每组根据再灌注的不同时间点(1d、3d、5d)又分为三个对应的亚组(n=6)。在预定时间点行开阔法迷宫检查，断头取脑，制备石蜡切片，HE染色计数海马CA1/3区存活细胞数，TUNEL法检测海马CA1/3区凋亡细胞。
结果:行为学检查发现，5min前脑缺血可导致沙土鼠探索活动活跃，IR组1d、3d、5d时间点10min爬行格子数是SH组的3倍、1.8倍及1.9倍。亚低温4h可显著减少沙土鼠的探索活动(各时间点爬行格子数较IR组分别减少115％、41％、52％)。5min前脑缺血海马CA1区1d、3d、5d的存活神经元数(存活率分别为67％、33％、15％)较SH组及HSH组显著减少。亚低温增加沙土鼠海马CA1各时间点的存活细胞(存活率增至85％、77％、58％)，较IR组分别增加28％、110％、287％(P＜0.01)。5min前脑缺血对CA3区影响较CA1区轻微，再灌注后1d点几无细胞死亡，3d、5d点有少许细胞死亡。亚低温可增加沙土鼠3d、5d点CA3区的存活细胞(增加14％、23％)(P＜0.05)。IR组各时间点凋亡细胞显著多于SH组及HSH组，亚低温能显著减少脑缺血引起的细胞凋亡,CA1区各时间点凋亡锥体细胞数分别仅为IR组的29％、35％、62％、(P＜0.01)，CA3区为38％、49％、45％(P＜0.05)。亚低温对未缺血鼠的行为学、存活及凋亡细胞均未有影响。
结论:本实验条件下4h亚低温对沙土鼠5min前脑缺血有确切的保护作用，增加沙土鼠海马的存活细胞，减少细胞凋亡，改善其行为学表现。
第二部分亚低温对沙土鼠前脑缺血再灌注损伤神经元MAPK活性及凋亡相关因子的影响
目的:通过动态观察脑缺血及亚低温(33℃，4h)处理后对沙土鼠前脑缺血再灌注后不同时间点海马各区的磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化p38(p-p38)，Bcl-2、Caspase-3的表达，探讨亚低温神经元保护作用的相关分子机制。
方法:动物模型同第一部分。随机分为假手术组(SH)，常温再灌注组(IR)，亚低温假手术组(HSH)，亚低温再灌注组(HIR)。每组根据再灌注的不同时间点(2h、4h、1d、3d、5d)又分为五个对应的亚组(n=6)。2h、4h组直接灌注取脑，制备石蜡切片，1d、3d、5d组采用第一部分的石蜡切片，用免疫组化法检测海马各区p-ERK、p-JNK、p-p38，Bcl-2、Caspase-3的表达，LeicaQwin图像分析系统行半定量分析。
结果:未缺血沙土鼠的海马CA3、DG区颗粒细胞及神经元树突上均有少量p-ERK的表达(OD值＞10)，CA1区未检测到p-ERK的表达。5min缺血可激活CA3、DG区ERK的活性，但对CA1区无影响。亚低温对未缺血及缺血鼠海马各区各时间点p-ERK的表达均无明显差异(P＞0.05)。SH组及HSH组CA1区均有少量p-JNK的表达(OD值大约为5)，CA3区几无p-JNK的表达。p-JNK在缺血后CA1区表达量多并有二次表达高峰(2h和1d)至5d时仍达到较高水平，CA3区的表达与CA1区相似，但各点的表达水平明显低于CA1区，4h时间点IR组表达减少与SH组比较无差异性(P＞0.05)。未缺血鼠及缺血鼠DG区均无p-JNK表达。p-p38缺血后的表达区域与p-JNK相似，但只有一次表达高峰(2h)；亚低温可以抑制脑缺血后海马CA1、CA3区p-JNK、p-p38早期的表达(2h、4h)，但对CA1区1d、3d、5d的表达及DG区的表达均无明显影响(与IR比较P＞0.05)。
未缺血沙土鼠海马三区神经元有少量Bcl-2蛋白表达，CA1区与CA3区相似较DG区略高。5min缺血后Bcl-2蛋白的表达在再灌注1d急剧并显著增高至峰值，3d时表达开始下降，5d时与SH组已无明显的差异。亚低温治疗组对CA1区各时间点及CA3、DG区的1d之前的Bcl-2蛋白表达与IR组相比无明显差异(P＞0.05)，但CA3/DG区在灌注3d、5d时间点的表达明显多于IR组。SH组及HSH组沙土鼠海马各区几无活化的Caspase-3表达(OD值＜5)。IR组沙土鼠海马CA1区Caspase-3在再灌注2h已大量表达，1d开始下降，5d时与SH组相比较无统计学意义。HIR组2h、4h时间点与SH组、HSH组比较无显著性差异，较IR组比较明显降低(P＜0.01)，1d、3d点表达较SH组、HSH组显著增加，与IR比较无明显差异。缺血及亚低温对沙土鼠海马CA3区Caspase-3表达的影响与CA1区相似但表达水平略低。亚低温可以抑制缺血再灌注后2h、4h时间点的Caspase-3的激活，对于1d、3d点的无明显影响。缺血及亚低温对DG区Caspase-3的激活无明显影响。
结论:缺血致JNK及p38激活在CA1区神经元凋亡及死亡中均发挥重要作用。亚低温可以抑制海马CA1区缺血再灌注早期p-JNK、p-p38的表达(2h、4h)，对p-ERK的表达无影响。还可抑制Caspase-3的早期激活，对Bcl-2的早期表达无影响，但增加了CA3/DG区3d、5d时间点的表达。亚低温的神经元保护作用与抑制CA1区JNK、p38的激活及Caspase-3的表达有关；亚低温使Bcl-2进一步激活可能与CA3/DG区的缺血耐受有关。