重组腺病毒基因转移载体被广泛应用于基因治疗和重组疫苗研究领域。目前,动物腺病毒常被应用于相应易感动物重要疫病的重组疫苗研究,并已显示出良好的安全性。本实验室在前期工作中,建立了以犬2型腺病毒(CAV-2)为载体表达狂犬病病毒弱毒株SRV9糖蛋白的重组CAV-2疫苗,免疫试验结果表明,该重组疫苗可诱导动物机体产生针对狂犬病病毒的具有保护水平的中和抗体。该重组腺病毒是针对复制非必须区E3区进行缺失并插入外源基因,外源基因只能以分泌形式进行表达,与完整的病毒颗粒相比,外源蛋白诱导的抗体水平较低,虽然已达到国际要求的保护水平,但仍有进一步提高的空间和必要。重组病毒免疫中和抗体水平较低的原因是多方面的,在很大程度上与外源蛋白产量不高以及相当数量的靶动物机体本身携带的抗腺病毒抗体相关。因此,本研究进行了以犬2型腺病毒主要衣壳蛋白——六邻体为基础表达外源性抗原表位的基因转移载体的探索性研究。腺病毒衣壳由三个主要衣壳蛋白构成:六邻体、纤突和五邻体基质。六邻体,是结构最大、数量最多的腺病毒衣壳蛋白,构成整个病毒粒子的衣壳表面。在成熟病毒粒子中,六邻体是以单体三聚化形成病毒的二十面体结构,因此每个病毒粒子共含有720个拷贝。人的2型和5型腺病毒晶体结构已经得到实验解析,每个六邻体单体的基底部由两个β折叠基序构成,从基底延伸出三个长环形成了分子顶端的“塔”区,形成病毒粒子的外部。比较不同血清型腺病毒六邻体蛋白发现,凸出于衣壳表面的环相对应的序列在氨基酸顺序和长度上都缺乏保守性,这些非保守区序列被称为超变区。基于人腺病毒不同血清型六邻体序列比对的早期研究,认为在六邻体蛋白分子中存在七个超变区,最近文献中报道了更精确的人2型腺病毒超变区的位置,并且发现第7超变区是由三个独立的非保守区构成,因此超变区数目最终确认为九个。研究表明超变区不参与维持六邻体结构的完整性,因此假设对其氨基酸残基进行修饰改造不会影响病毒的包装。近来已有许多关于人腺病毒六邻体超变区改造成功的报道,分别是在不同超变区插入或替换为不同长度的外源序列肽段,突变后显示重组病毒的形成、稳定性和天然受体介导的病毒感染等生物学特性同原始病毒相近,并且能够检测到外源基因以不同程度和形式的表达。为了探索以犬2型腺病毒六邻体蛋白为基础基因转移载体研究的可行性,建立一种犬腺病毒抗原表位展示技术,本研究通过生物信息学手段分析CAV-2六邻体蛋白结构,推断超变区的位置,然后在不同超变区替换入狂犬病病毒糖蛋白线性表位,通过重组病毒的包装探索CAV-2六邻体蛋白中可修饰的区域,验证超变区的位置,从而为构建一种新型的基因转移载体,并作为抗原展示性疫苗研究奠定基础。本实验首先通过PCR分别获得犬2型腺病毒疫苗株YCA-18和弱毒株CC0710六邻体蛋白基因,进行克隆及测序,并推导氨基酸序列,与其它已知不同血清型的哺乳动物腺病毒六邻体蛋白序列进行比对,利用蛋白质同源模建方法预测CAV-2六邻体蛋白的二级、三级结构,与已经实验方法解析的人2型和5型腺病毒六邻体蛋白结构进行比较分析,推导出CAV-2六邻体蛋白超变区的可能位置。根据不同超变区在六邻体蛋白中所处的空间位置,选择位于蛋白表面的第2、3、5和7超变区作为改造靶点。在本实验室前期构建的CAV-2感染性全基因组质粒pPolyII-CAV-2的基础上,通过重叠延伸PCR方法对超变区内的氨基酸残基进行缺失并替换为狂犬病病毒糖蛋白中和性线性表位WSPIDI,并在两侧加入柔性氨基酸LGS,分别构建了基于上述四个超变区的犬2型腺病毒六邻体蛋白基因转移载体。最后,通过脂质体介导重组全基因组转染MDCK细胞。在严格控制重组CAV-2全基因组质粒质量的情况下,虽经多次和重复转染,未能检测到重组腺病毒粒子的产生。Western-blotting分析转染后细胞,结果能够检测到六邻体蛋白的表达,说明CAV-2重组全基因组能够在转染体系中进行复制、转录和翻译功能,进一步说明腺病毒包装可能是影响无法获得重组病毒的重要因素。重组CAV-2六邻体蛋白空间结构模建分析发现,HVR2,HVR3和HVR5的突变导致loop1整体结构发生松散或紧缩的趋势,其中HVR2区域在缺失插入后形成一个多余的α螺旋,HVR3和HVR5在突变序列后侧可能的一个β折叠结构变为无规卷曲。HVR7位于loop2表面,天然二级结构预测为无规卷曲,在替换入线性表位后,出现一个额外的β折叠结构,引起loop2顶端构象改变。另外,在六邻体loop中存在多个表面衣壳蛋白相互作用位点,改造区域引起的局部空间构象改变,可能使得六邻体蛋白单体之间以及与其他蛋白相互对接的部位发生变形、错位,HVR2中的156～159位氨基酸位于六邻体蛋白的相互结合区域,其氨基酸残基被缺失替换后可能影响六邻体蛋白单体之间的相互作用力。综上所述,基于人2型和5型腺病毒六邻体成功改造实例所设计的上述四个位点的突变修饰,不能成功包装出重组病毒颗粒。从结构水平分析原因,改造可能影响了CAV-2六邻体蛋白局部空间构象和蛋白之间的相互作用,导致其包装过程受阻,最终未能获得重组CAV-2。本实验对CAV-2六邻体蛋白结构和超变区位置的分析,以及进行的CAV-2结构蛋白基因转移载体的研究,为下一步构建新型展示性犬2型腺病毒基因转移载体提供理论和实验基础。