每17秒就会危害一人,是威胁国民健康的头号杀手,同时给国民经济造成巨大负担,其中以缺血性脑血管病患者为主,目前溶栓治疗应用有限,故及时有效的神经保护在临床治疗中十分重要。继发性脑损伤是目前公认的脑梗死后主要病理机制,包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等方面,其中炎症反应是造成继发性脑损伤的重要环节。脑梗死后炎症细胞浸润,释放大量炎症因子,造成神经元等的损伤,最终导致神经功能缺损。小胶质细胞是公认的中枢神经系统的免疫细胞,可以发挥吞噬细胞碎片等作用并参与多种病理反应。氯膦酸二钠脂质体是巨噬细胞清除剂,其被巨噬细胞吞噬后会影响细胞能量代谢最终导致细胞死亡,小胶质细胞在中枢神经系统发挥巨噬细胞的作用,故我们推测可以通过皮层注射氯膦酸二钠脂质体的方法抑制小胶质细胞,减少其数量。小胶质细胞在中枢神经系统受损时,可被激活并分泌炎症因子等物质,参与炎症反应,通过减少小胶质细胞数量,抑制其功能,进而观察小胶质细胞在脑梗死后炎症反应中发挥的作用。本实验旨在研究皮层注射氯膦酸二钠脂质体是否能作为一种有效抑制小胶质细胞的方法,同时观察小胶质细胞在脑梗死后炎症反应中发挥的作用,为临床治疗寻找新的靶点。方法:选用8~10周龄雄性C57BL/6小鼠,采用显微镜下电烧灼法制备永久性小鼠局灶皮层梗死模型(dMCAO)。药物干预为造模前24小时和造模后24小时,分别显微镜下立体定位仪下小鼠大脑皮层微量注射氯膦酸二钠脂质体,模型组给予等量磷酸盐缓冲液脂质体,假手术组给予等量生理盐水。实验分三部分。实验一:观察皮层注射氯膦酸二钠脂质体是否能有效抑制小胶质细胞。第一部分,实验动物随机分为用药组(Clodronate组)、对照组(PBS组)和假手术组(NS组),分别给予相应药物注射后,于给药后1天进行免疫荧光染色观察小胶质细胞数量。第二部分,实验动物随机分为用药组(clodronate组)、模型组(mcao组)和假手术组(sham组),造模前后1天分别给予相应药物皮层注射,于造模后1、3天进行免疫荧光染色观察小胶质细胞激活或抑制情况,观察其分型;于造模后1、3天进行流式细胞学检测观察小胶质细胞及中性粒细胞表达情况。实验二:观察皮层注射氯膦酸二钠脂质体对实验性脑缺血小鼠神经功能的影响。用药组、模型组、假手术组小鼠给药方式同前,分别于造模后3、7、14、28天采用rotarod法进行行为学评分。实验三:探讨皮层注射氯膦酸二钠脂质体对脑梗死后急性期炎症反应的影响。用药组、模型组、假手术组小鼠给药方式同前,分别于造模后1、3天进行westernblot检测观察炎症因子tlr4、myd88、il-1β、tnf-α的蛋白表达情况;于造模后1、3天进行TTC染色观察测定脑梗死体积;于造模后1、3天用干湿重法测定脑水肿程度。结果:1皮层注射氯膦酸二钠脂质体减少小胶质细胞数量,并减弱其活性。confocal结果显示,给药后1天,用药组同对照组相比,用药侧皮层iba1+细胞数明显减少,减少率达31.6%,iba1荧光强度减弱,其差异具有统计学意义(p<0.05)。对照组同假手术组相比,iba1+细胞数无明显变化(fig.1,fig.2)。用药组同模型组相比,梗死侧iba1+细胞数减少的同时,neun+细胞数未见明显变化(p>0.05)(fig.3)。造模后1、3天,氯膦酸二钠脂质体用药组同模型组相比,梗死侧iba1+细胞数减少,iba1荧光强度减弱,小胶质细胞形态改变,组间差异有统计学意义(p<0.05)(fig.4,fig.5)。梗死对侧未见iba1+细胞数减少及iba1荧光强度减弱,用药组、模型组及假手术组间差异无统计学意义(p>0.05)(fig.6,fig.7)。用药组同模型组相比,梗死侧iba1/tlr4共标细胞数减少(fig.8,fig.9),且组间差异有统计学意义(p<0.05);梗死侧iba1/cd206共标细胞数减少(fig.10,fig.11),且组间差异有统计学意义(p<0.05);梗死对侧iba1/tlr4、iba1/cd206共标细胞数无明显变化,组间差异无明显统计学意义(p>0.05)。2皮层注射氯膦酸二钠脂质体减少皮层小胶质细胞数量,不影响中性粒细胞数量流式细胞学检测结果显示,造模后1、3天,氯膦酸二钠脂质体用药组同模型组相比,梗死侧iba1+细胞数减少,其组间差异具有统计学意义(p<0.05)(fig.12,fig.13)。梗死侧ly-6g+细胞数无明显变化,其组间差异不具有统计学意义(p>0.05)(fig.14,fig.15)。3皮层注射氯膦酸二钠脂质体改善实验性脑缺血小鼠神经功能氯膦酸二钠脂质体用药组、模型组、假手术组小鼠于造模后3、7、14、28天采用rotarod法进行神经功能评分。假手术组小鼠均未见明显神经功能缺损,梗死后3、7、14、28天用药组、模型组均存在神经功能缺损,用药组小鼠同模型组相比,神经功能有所改善,且在不同时间点各组间差异存在统计学意义(p<0.05)(fig.16)。4皮层注射氯膦酸二钠脂质体减小脑梗死体积TTC染色结果显示,假手术组小鼠未见梗死灶。造模后1天,氯膦酸二钠脂质体用药组同模型组相比,脑梗死体积降低,且组间差异有统计学意义(clodronatevs.mcao:10.48%±0.65%vs.14.93%±1.10%,p<0.05)。造模后3天,氯膦酸二钠脂质体用药组同模型组相比,脑梗死体积减小,且组间差异存在统计学意义(clodronatevs.mcao:9.66%±0.39%vs.12.64%±0.30%,p<0.05)(fig.17,table.1)。5皮层注射氯膦酸二钠脂质体对脑水肿无明显影响干湿重法检测结果显示,假手术组小鼠双侧脑组织含水量均未见明显变化;用药组、模型组同假手术组相比,梗死侧脑组织含水量明显升高,组间差异均有统计学意义(p<0.05);造模后1天,氯膦酸二钠脂质体用药组同模型组相比,梗死侧脑组织含水量有降低趋势,但组间差异无统计学意义(clodronatevs.mcao:80.58%±0.88%vs.82.80%±0.69%,p>0.05);造模后3天,氯膦酸二钠脂质体用药组同模型组相比,梗死侧脑组织含水量略降低,改变不明显,组间差异无统计学意义(clodronatevs.mcao:79.02%±0.82%vs.80.88%±0.52%,p>0.05)(table.2)。6皮层注射氯膦酸二钠脂质体抑制tlr4、tnf-α、myd88、il-1β的表达,下调炎症反应westernblot检测结果显示,造模后1天,氯膦酸二钠脂质体用药组小鼠梗死侧大脑皮层炎症因子tlr4、tnf-α、myd88、il-1β的蛋白表达量同模型组相比,表达量下降,其组间差异有统计学意义(p<0.05);造模后3天,用药组小鼠梗死侧大脑皮层炎症因子tlr4、tnf-α、myd88、IL-1β的蛋白表达量同模型组相比,表达量下降,其组间差异有统计学意义(P<0.05)(Fig.18,Fig.19);造模后1、3天,小鼠梗死对侧大脑皮层炎症因子TLR4、TNF-α、MyD88、IL-1β的表达变化各组间无统计学差异(P>0.05)。结论:皮层注射氯膦酸二钠脂质体可以有效减少实验动物大脑皮层注射区周围小胶质细胞数量,并抑制其活性,同时对皮层其它细胞无明显影响。小胶质细胞介导炎症反应参与脑梗死后继发性炎症反应,减少小胶质细胞数量、降低小胶质细胞活性可有效减少炎症因子的分泌,减轻脑梗死后炎症反应,适当降低脑水肿,减小脑梗死体积,从而减轻神经功能缺损,促进神经功能恢复,发挥神经保护作用。皮层注射氯膦酸二钠脂质体可抑制IL-1、TNF-α等炎症因子水平,从而减轻炎症反应发挥脑保护作用,其作用机制可能与TLR4信号通路有关。