论文部分内容阅读
菵草（Beckmannia syzigachne）是一种常见的禾本科杂草,在长江流域及西南地区的稻麦轮作和稻油轮作田为害小麦和油菜的生产安全。精噁唑禾草灵是防除小麦田菵草等禾本科杂草的常用除草剂,其作用靶标是乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）,具有低毒、高效、持效期长等特点。但是由于长期依赖该类除草剂,使得菵草对精噁唑禾草灵逐渐产生了抗药性,在田间推荐剂量下已无法有效防除菵草。甲基二磺隆是防除抗精噁唑禾草灵杂草主要的替代药剂,其作用靶标是乙酰乳酸合成酶（ALS）。但是,部分地区的菵草对甲基二磺隆也产生了抗药性,这类多抗性菵草严重威胁小麦的生产安全。本文对采自安徽的多抗性菵草种群（AH-02）进行靶标抗性研究,并未发现任何已报道的赋予靶标抗性的氨基酸突变位点和突变形式,说明其可能存在非靶标抗性。在此基础上,重点研究该种群的非靶标抗性机理,以期为科学防治麦田多抗性菵草提供理论指导。主要研究结果如下:在整株水平上,对AH-02种群进行抗性初筛试验,分别喷施精噁唑禾草灵(62.1 g a.i.ha-1)和甲基二磺隆(15.75 g a.i.ha-1)的田间推荐剂量。结果表明,该种群对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆均产生了抗药性。对菵草质体型ACCase基因的CT区域和ALS基因的保守区域进行克隆和测序,比对结果显示,在AH-02抗性种群中未发现任何已报道的赋予杂草靶标抗性的靶标突变位点和突变形式。将确定基因背景的抗、敏型菵草植株在温室中繁育一代,获得纯化的F1代植株,以尽可能的减少植株间的遗传背景差异;对F1代植株的质体型ACCase基因的CT区域和ALS基因的保守区域同样进行克隆和测序,比对结果同田间种群一致,未发现任何已报道的赋予杂草靶标抗性的靶标突变位点和突变形式。采用整株测定方法测定P450s酶抑制剂胡椒基丁醚（Piperomyl butoxide;PBO）和马拉硫磷（Malathion）分别对F1代菵草植株精噁唑禾草灵和甲基二磺隆抗性水平的影响。结果发现,PBO可显著提高精噁唑禾草灵对F1代菵草植株的防效,其鲜重抑制中量(50%growth reduction;GR50)值与单喷精噁唑禾草灵相比下降了45.7%-60.0%;马拉硫磷亦能够提高甲基二磺隆对F1代菵草植株的防效,其GR50值比单喷甲基二磺隆下降了48.9%-65.6%,表明该种群存在P450s酶介导的非靶标抗性。采用整株测定方法对F1代菵草的抗性谱进行测定,结果发现其对精噁唑禾草灵（抗性倍数（Resistance index;RI）=31.2）、精喹禾灵（RI=2.8）、炔草酯（RI=4.2）分别表现为高抗、低抗和低抗;对烯禾啶（RI=2.7）和烯草酮（RI=1.9）分别表现为低抗和敏感;对唑啉草酯（RI=1.7）敏感;对甲基二磺隆（RI=2.6）、氟唑磺隆（RI=7.7）、啶磺草胺（RI=23.6）分别表现为低抗、中抗和高抗;对异丙隆敏感,其GR50值为63.3±3.2,仅约为田间推荐剂量的6.0%。利用转录组测序（RNA-Sequencing）技术,以遗传背景一致的抗、敏型F2代菵草植株为材料,筛选与精噁唑禾草灵代谢抗性相关的差异基因。结果筛选到13个可能与精噁唑禾草灵代谢相关的候选差异基因,分别是4个P450s、2个GSTs、1个GTs、2个ABC transporters和4个植物抗逆相关的基因（1个类胡萝卜素、1个脱落酸、1个水杨酸和1个肌醇基因）;通过实时荧光定量PCR技术,以UBQ为内参基因,设计相关引物,对这13个候选差异基因的表达量进行验证,测序样品和后代处理样品中13个差异基因的表达量与RNA-seq结果一致。从13个候选差异基因中选择两个基因（c32066g2和c21365g2分别注释到GSTU17和GT73C1）做进一步的功能验证。pPZP211作为表达载体,成功构建两个基因的植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法分别获得了22株转GSTU17基因和17株转GT73C1基因的阳性二穗短柄草（Brachypodium distachyon）植株（Bd-F0）。对转基因Bd-F1代植株的性状测定分为两个方面:在整株水平上,精噁唑禾草灵和甲基二磺隆推荐剂量处理后,GSTU17和GT73C1转基因植株的长势均好于对照植株;在分子水平上,GSTU17和GT73C1基因受精噁唑禾草灵和甲基二磺隆的诱导,与除草剂处理前相比,两个基因的表达量明显上调。综上所述,本研究初步明确了该多抗性种群对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆的抗性水平及其抗性谱。靶标酶基因的测序比对未发现任何已报道的赋予杂草靶标抗性的靶标突变位点和突变形式,且P450s酶抑制剂对药剂有明显的增效作用,说明该种群存在P450s介导的非靶标抗性。利用RNA-seq技术比较抗、敏植株在精噁唑禾草灵处理前后转录水平上的变化情况,筛选获得一些与精噁唑禾草灵代谢相关的差异基因,丰富了杂草的基因库,并通过实时荧光定量PCR技术进行了初步的表达量的验证。通过农杆菌介导的遗传转化技术对其中两个候选差异基因（GSTU17和GT73C1）进行体外功能验证,对获得的阳性转基因植株的性状检测与预期相符,为研究杂草抗性基因的功能验证,科学合理制定杂草的防治策略提供理论依据。