肝纤维化(liver fibrosis)是一系列损伤因子作用后引起的一种可逆性性损伤后修复的过程,其主要特征是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积。在当今社会,是一个预后极差且病死率很高的疾病,严重威胁着人类的健康。当肝脏受到致病因子刺激时,静止状态的HSC被激活转化为肌成纤维样细胞,细胞增殖加快,胶原大量沉积。因此研究HSC增殖、凋亡以及迁移机制对研究肝纤维化具有重要意义。上皮间质转化(epithelial epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指细胞由上皮表型转化成为间质表型。研究表明EMT与胚胎发育、纤维化、器官再生以及肿瘤转移相关。EMT参与了静息HSC转化为肌成纤维细胞表型HSC的过程。Goosecoid(GSC)属于同源异型框(homeobox)转录因子,在原肠胚形成、耳泡的发育、乳腺癌细胞发生中,GSC作为组织者基因之一,均可诱导EMT,促进细胞的迁移。目前,GSC已成为公认的诱导EMT的转录因子,用于EMT的研究。GSC可诱导胚胎发育及肿瘤进展相关的EMT,而其在器官纤维化相关EMT中的作用尚无报道。TGF-β是促进肝纤维化的关键因素。在胚胎发育及肿瘤进展中,TGF-β均可上调GSC的表达,但GSC在肝纤维化中的作用尚不明确。目的:明确GSC在肝纤维化及HSC活化中的表达情况,研究GSC对HSC活化、增殖、凋亡及迁移的影响。为肝纤维化的治疗提供新靶点。方法:本实验通过腹腔注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型作为模型组,腹腔注射Oil作为对照组,在体内观察肝纤维化中GSC的变化,通过HE染色观察肝脏大体形态,Masson染色观察胶原变化,通过免疫组化法研究小鼠肝脏中α-SMA、Collagen I及GSC的表达。并用TGF-β刺激LX-2细胞活化,在体外观察HSC活化后GSC的变化,在体外用小干扰RNA敲低HSC中GSC,用Westen blot分析、Real-time PCR方法观察GSC和HSC活化指标α-SMA及Collagen I的表达变化,用CCK-8及Br Du掺入实验研究敲低GSC对HSC增殖的影响;用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况,并进一步应用Western Blot检测凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的活性及表达,用划痕实验研究敲低GSC对HSC迁移的影响。结果:1小鼠肝纤维化形成过程中GSC表达量升高HE结果显示对照组:肝脏组织结构正常,肝细胞沿中心静脉呈放射状排列,排列整齐,肝细胞大小、形态规则,无脂肪变性以及炎细胞浸润;模型组中正常肝小叶结构消失,肝细胞排列紊乱,少量炎细胞浸润。Masson染色结果显示模型组纤维结缔组织明显增多。IHC结果显示,较对照组,模型组肝纤维化指标α-SMA、Collagen I表达量增多,GSC表达量明显高于对照组,以上结果表明CCl4腹腔注射可诱导明显的肝纤维化,并且在此过程中GSC表达量升高。2体外应用TGF-β诱导HSC活化可上调GSC表达Western Blot分析结果显示,用TGF-β干预人HSC细胞系LX-2后,HSC活化指标α-SMA及Collagen I的蛋白表达量较Control组显著升高;同时GSC的蛋白表达量显著升高。Real-time PCR结果显示,与Control组相比,TGF-β干预组的HSC活化指标α-SMA及Collagen I的m RNA水平明显升高;并且GSC的m RNA水平显著升高。以上结果表明,GSC与HSC活化可能具有正相关关系。3体外应用si RNA敲低GSC可抑制HSC活化Real-time PCR结果表明,si GSC转染48 h后,GSC的m RNA水平明显下降,转染72 h后进一步下降,表明GSC被有效敲低。与转染si Control组相比,用si RNA敲低GSC后,HSC活化指标α-SMA及Collagen I m RNA水平显著降低。Western Blot分析结果显示,与转染si Control组相比,转染si GSC后,HSC活化指标α-SMA及Collagen I的蛋白表达量显著降低。表明GSC可促进HSC活化。4敲低GSC抑制HSC增殖用si GSC转染LX-2,CCK-8试验检测细胞活力,结果显示,与转染si Control组相比,转染si GSC 72 h后,OD450值明显降低。用Brd U掺入实验检测细胞DNA合成情况,评估细胞增殖情况。结果显示,转染si GSC后,DNA合成明显减少。提示GSC可促进LX-2增殖。5敲低GSC不影响HSC凋亡Western Blot分析结果显示,与si Control组相比,转染si GSC后,凋亡相关蛋白caspase-3的活性及PARP的表达无显著变化;用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡。结果显示转染si Control组与转染si GSC组的凋亡细胞百分比无统计学差异。表明GSC不影响HSC凋亡。6敲低GSC抑制HSC迁移功能细胞创伤愈合实验结果显示,在LX-2中,转染si GSC组较转染si Control组细胞划痕愈合明显减慢,提示GSC可能促进HSC迁移。结论:1在肝纤维化形成及HSC活化中,GSC表达升高。2 GSC可促进HSC活化、增殖及迁移。3 GSC不影响HSC凋亡。