致病菌在世界各地的医疗卫生中给人类带来了巨大的困扰,根据美国疾病控制中心的的统计数据,美国每年有超过200万由细菌引起的感染患者,而且由于传统抗生素在世界各地无节制的使用,耐药病源菌不断出现,以上病例中就有2.3万例由耐药性致病菌引起。因此如何攻克耐药菌出现的难题已然成为现代医学所面临的一项重要挑战。抗菌肽(AMPs)是体液先天免疫系统的基础效应分子,广泛存在于动物体内,是抵御病原体的第一道防线。这些长度为7至50个氨基酸的生物活性肽也参与细胞过程的调节,如细胞凋亡,以及内分泌和神经内分泌系统的调节。本课题组从海南沼蛙的皮肤组织中克隆得到Temporin-GHc(以下简称GHc)、Temporin-GHd(以下简称GHd)和Brevinin-GR23(以下简称GR23),化学合成后对三种抗菌肽进行抗菌活性分析。经螺旋轮和3D结构预测分析,GHc和GHd呈α-螺旋结构,亲水性氨基酸和疏水性氨基酸规则的排列两侧,具有完美的两亲性。圆二色谱结果显示GHc和GHd在生理环境下(0.9%NaCl)主要以无规则卷曲结构为主,而在疏水环境下(30 mM SDS和50%TFE)则以α-螺旋结构为主。平板打孔法显示GHc和GHd对变异链球菌(Streptococcus mutans)具有抑制活性,其最低抑制浓度(MIC)分别为12.6μM和13.1μM。GHc和GHd经过不同的理化因素(UV照射、NaCl浓度、加热温度和酸碱度等)处理后,仍然能保持对&mutans的抑制活性,表明其具有良好的热稳定性和结构稳定性。激光共聚焦显微镜和核酸泄露实验结果表明GHc和GHd能改变S.mutans细胞膜的通透性,导致细菌细胞内的大分子物质外泄而死亡。凝胶阻滞实验表明GHc和GHd能与细菌体外DNA结合,形成大分子复合物并降低其迁移率。当GHc或GHd与细菌孵育后,细菌DNA合成减少,可能是抗菌肽作用于细菌体内DNA后干扰其合成造成的,但也有可能是通过改变细胞膜造成大分子物质外流而引起的。结晶紫染色法和MTT法测定生物被膜的结果显示,2×MIC的GHc(25.2 μM)和GHd(26.2 μM)时对S.mutans细菌起始贴附的抑制率均超过90%;对已生成6 h的S.mutans生物被膜抑制率为61.6-67.2%;当S.mutans的生物被膜生长24 h后,对生物被膜的破坏率下降至20%左右。结果表明GHc与GHd能较好地抑制S.mutans生物被膜形成初始阶段的贴附作用,对早期形成的生物被膜也有一定的破坏作用,但随生物被膜生成时间的延长,对已生成生物被膜的破坏率下降明显。GHc和GHd均能抑制 S.mutan 胞外多糖(EPS)的产生,在 1×MIC 时,GHc(12.6 μM)和 GHd(13.1μM)对S mutans合成水溶性胞外多糖和非水溶性胞外多糖的抑制率分别是49.6%和17.2%,42.6%和23.9%。实时荧光定量PCR结果表明GHc和GHd能够下调S.mutans生物合成胞外多糖基因,葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase,Gtfs)的表达,从而干扰了 S.mutans生物被膜的生成。GHc和GHd对人红细胞具有一定溶血活性,50%的溶血率分别为100 μM和50 μM。但在S.mutans存在的情况时对人红细胞的溶血毒活性下降,表明GHc和GHd对细菌的选择性更高。在200 μM的浓度的范围内,GHc和GHd对人口腔上皮细胞无毒性。实验结果表明,GHc和GHd能抑制口腔致病菌S.mutans及其生物被膜的形成,对人口腔上皮细胞无毒性,为其进一步的开发设计成为抗龋齿药物提供依据。经过平板打孔法和吸光值法检测GR23对金黄色葡萄球菌(Staphylococcu aureus)有抑制活性,最低抑制浓度为16.6 μM。GR23的螺旋轮和3D结构的预测显示其具有两亲性,呈α-螺旋结构。在亲水性环境下(PBS)主要以无规则卷曲结构存在,而在疏水性环境中则以α-螺旋结构为主。经过不同理化因素处理后的GR23仍然能保持抑制S.aureus的活性,稳定性好。GR23作用于S.aureus时,能改变细菌细胞膜的通透性,造成细菌内容物外泄。经凝胶阻滞实验表明,GR23能与S.aureus的DNA体外结合。结晶紫和MTT法测定GR23对SS.aureus初始细胞附着的抑制率在16.6 μM以上时均超过90%,对S.aureus生物被膜生长6 h的抑制率分别为68%和41%,而对生长24 h后的生物被膜抑制率降低至20%。GR23还能抑制浮游生长的S aureus胞外多糖的产生,对水溶性胞外多糖和非水溶性胞外多糖的抑制率分别71.8%和52.2%。GR23(终浓度为200 μM)对健康人血红细胞没有显著的溶血毒性。实验结果显示,GR23具有抑制S.aureus及其生物被膜的活性,无明显细胞毒性,为其进一步开发成为抗感染药物打下基础。