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脂肪酶可以催化三酰甘油水解生成游离脂肪酸和甘油。南极假丝酵母脂肪酶A(Candida antarctica Lipase A,CALA)是一类典型的微生物脂肪酶,具有较好的热稳定性和界面活性且已被商业化生产。研究表明,该酶具有脂肪酸选择性,尤其是偏好短链脂肪酸和饱和脂肪酸,因此该脂肪酶被广泛应用于制备功能性油脂、富集微生物油脂中多不饱和脂肪酸等。然而,CALA对长链多不饱和脂肪酸选择性较差,不能利用该酶直接水解多不饱和脂肪酸。所以有必要开发具有较好的温度稳定性以及长链脂肪酸选择活性的新型脂肪酶。曾有报道称CALA具有甘油三酯sn-2活性,但现阶段研究表明,CALA并不具有区域选择性。鉴于CALA具有较好的温度耐受性以及其在脂肪酶家族中代表了新的类型,本研究以CALA为“诱饵”进行新型脂肪酶的挖掘、异源表达,并对其基本酶学性质、水解微生物油脂时的区域选择性、脂肪酸选择性进行了探究。主要内容和结果如下:(1)以CALA的氨基酸序列为查询序列,在数据库中搜索相关脂肪酶序列,并建立系统发育进化树。结果表明,CALA及其所在分支与其他脂肪酶同源性较低。最终选取与CALA同源性分别为97%、55%、35%的三个脂肪酶,分别是来源于Moesziomyces antarcticus T-34的Man Lip(GAC73196.1),Pseudozyma hubeiensis SY62的Ph Lip(XP＿012187489.1)和Ustilaginomycotina sp.SA807的Us Lip(PWN48207.1),将其编码基因构建到质粒p PIC9K上。(2)将三个重组质粒转入毕赤酵母GS115中,筛选得到阳性转化子。通过甲醇诱导脂肪酶表达,通过SDS-PAGE电泳分析证明重组酵母已表达与理论分子量(约50 k Da)一致的脂肪酶,并且发现诱导5天蛋白表达量最大。将重组脂肪酶利用硫酸铵沉淀法进行浓缩,浓缩后三个重组脂肪酶Man Lip、Ph Lip和Us Lip蛋白浓度分别为0.561 mg/m L、0.486 mg/m L、1.17 mg/m L。(3)对重组脂肪酶Man Lip、Ph Lip和Us Lip的基本酶学性质进行探究,结果表明,Man Lip、Ph Lip和Us Lip的最适催化温度分别为70℃,60℃,60℃,最适催化p H值分别为9.0、9.0和8.0。在三个重组脂肪酶中,Ph Lip具有较好的温度和p H稳定性。三种重组脂肪酶对不同碳链长度的对硝基苯酚脂肪酸酯的活性不同,其中Ph Lip对对硝基苯酚月桂酸酯(C12)和棕榈酸酯(C16)活性最高,其他两个脂肪酶对这两种底物的活性也均高于CALA,而CALA则对对硝基苯酚辛酸酯(C8)的活性最高。(4)将CALA与重组脂肪酶运用于卷枝毛霉油脂水解,并用核磁共振仪分析水解产物,探究重组脂肪酶的区域选择性。研究结果表明,与对照组相比,四个试验组核磁共振图谱均显示甘油三酯的酯键无差别断裂,因此CALA和三个重组脂肪酶对卷枝毛霉油脂的水解都无区域选择性。选取三个重组脂肪酶中催化性质较优的Ph Lip进行多不饱和脂肪酸偏好性探究,通过薄层层析分离水解产物中游离脂肪酸条带,并通过气相色谱仪分析得到,重组脂肪酶Ph Lip水解卷枝毛霉油脂时,对GLA(C18:3)表现出一定的偏好性,并且其对脂肪酸的选择性表现为:多不饱和脂肪酸>单不饱和脂肪酸>饱和脂肪酸,且催化性质优于CALA。