论文部分内容阅读
蓝藻又称蓝细菌，广泛地分布在地球上，因其具有光合作用和固氮作用，对生物圈的碳氮循环有重要的贡献，因此，深入地了解这种古老的原核生物具有非常重要的意义。Synechococcussp.PCC7002是一种自滩涂分离的单细胞海洋蓝藻，具有生长迅速，遗传操作简单，全基因组测序注释完成等优势，因此作为研究光合作用及蓝藻应激反应的模式物种被广泛使用。本研究通过功能基因组学的工具和手段，结合分子生物学和遗传学的方法，对Synechococcussp.PCC7002长期高温适应的分子机理与调控模式进行探索，对其乙酰化蛋白质组，与微囊藻附生菌的共生关系进行深入分析和研究，并对Synechococcussp.PCC7002在鱼类饲料制备与水稻转基因方面的应用进行了初步尝试。 基于链特异RNA-Seq及TMT标记蛋白定量数据，研究了Synechococcussp.PCC7002在长期高温环境中的全局转录组和蛋白质组的变化特征。在长期高温环境中，在RNA水平和蛋白质水平上显著上调的基因主要包括信号转导系统，热激蛋白，活性氧清除的相关基因，DNA复制和修复的相关基因，RNA降解的相关基因;显著下调的基因主要有光合系统相关的基因，包括光反应和暗反应，呼吸电子传递链，ATP的合成，核糖体蛋白，RNA转录相关的基因。表明长期的高温环境造成藻细胞损伤，藻细胞以降低生长速率为代价进行细胞损伤的修复。对Synechococcus sp.PCC7002长期高温适应的调控模式进行了分析，激酶HiK34的同源基因SYNPCC7002_A0442很可能是Synechococcus sp.PCC7002高温适应的一个重要的正调控激酶，而SYNPCC7002_A0486有可能是该激酶的一个效应器。转录因子中rpoD(sigD)因子可能是参与正向调控的一个sigma因子。且在Synechococcus sp.PCC7002中，可能存在除hrcA基因外的其他方式来调控hsp60家族基因。同时还发现一批功能未知的基因在Synechococcussp.PCC7002长期高温适应中显著差异表达，这些基因的功能有待于进一步研究。 通过对Synechococcus sp.PCC7002的乙酰化蛋白质组数据分析，鉴定到802个乙酰化蛋白和其中的1653个独特的赖氨酸乙酰化位点，这些蛋白参与不同的细胞进程，主要有光合作用和蛋白质合成等。通过对这些位点的结构分析，发现11个在统计学上显著富集的乙酰化位点基团，其中与之前的发现一致的有三种模式，新发现两个极性带负电的氨基酸，即谷氨酸(E)在-1的位置，天冬氨酸(D)在-1/+1或者-4/+4位置这几种模式。本研究证实在高温条件下PsbO的失活突变株会降低光合放氧的效率，PsbO蛋白上的三个乙酰化位点，两个位于保守的KL和DPKGR区域。鉴于乙酰化在原核生物和真核生物进化中都高度保守，我们推测其他物种的PsbO蛋白这两个位点也可能发生乙酰化修饰并发挥功能。深入研究后发现，光系统Ⅱ上的锰稳定蛋白(PsbO)上第190位的赖氨酸乙酰化可能在高温条件下参与负调控放氧活性。这些研究为进一步深入理解蛋白PsbO的乙酰化对放氧进程的调控作用提供参考依据。 本研究首次采用梯度提高盐度的方法，成功的构建了一个小型的菌藻共生体系，通过宏基因测序，分析该系统的物种组成，成功的拼接两株新发现细菌的基因组Mesorhizobium sp.TAIHU和Pseudomonas stutzeri TAIHU，为进一步的宏转录组等分析提供了可靠的参考基因组序列。与此同时，从代谢途径细致的阐述了VB12代谢在系统中的重要作用。附生细菌为生产者Synechococcus sp.PCC7002提供生长所必需的VB12，而作为回报，生产者为附生菌提供生命活动所需的碳源和其他能量物质。 本研究通过分子遗传学操作手段，成功将鲫鱼干扰素基因CaINF转入Synechococcus sp.PCC7002中，并将藻粉以质量比为2％的含量添加到斑马鱼饲料中。添加有转基因蓝藻的鱼饲料能成功的诱导斑马鱼体内干扰素基因inf1的表达，实验组斑马鱼体内干扰素基因表达高于对照组约3倍。使用鲤春病毒血症病毒（简称SVCV）对斑马鱼的攻毒实验表明，饲料中添加转基因蓝藻，斑马鱼的存活率比添加野生型蓝藻的对照组高近30％，说明CaIFN对成鱼具有保护作用。本研究首次发现，通过蓝藻作为载体对干扰素进行表达，实现了投喂也可达到免疫保护的目的，为解决渔业上的抗病毒策略提供了新的解决方式。 本研究将蓝藻基因SYNPCC7002_A0987与SYNPCC7002_A1180基因通过分子手段转入水稻广占63黄叶突变体中，得到新的转基因突变株。新的转基因突变株能部分回补广占63黄叶突变体的生长性状，使其在长江流域能生长分蘖结籽，并且带有黄色选择标记，恢复其不育系的作用。通过将蓝藻基因SYNPCC7002_A0987与SYNPCC7002_A1180基因转入水稻日本晴中，经过3代筛选，得到基因组水平和转录水平都是阳性的转基因植株，SYNPCC7002_ A0987转化日本晴植株没有明显表型，但SYNPCC7002_ A1180转基因植株株高明显变矮，在得到阳性转基因植株后可以开展两种转基因水稻的抗逆境方向研究。 本研究一方面利用组学及分子生物学的方法对Synechococcus sp.PCC7002的高温适应机制、乙酰化蛋白在细胞进程中的调控作用及菌藻共生体系的组份和相互关系进行基础研究，一方面尝试将Synechococcus sp.PCC7002用于生产实践之中，不仅将Synechococcussp.PCC7002本身的优质基因用于经济作物改良，也利用Synechococcussp.PCC7002生长迅速，无毒害的特质使之成为优良饲料添加剂的载体，为Synechococcussp.PCC7002的基础研究以及工业应用奠定了理论和技术基础。