血吸虫病（schistosomiasis）是一种严重危害公众健康和社会发展的人兽共患寄生虫病，我国是日本血吸虫病流行最严重的国家之一，到2009年底，我国仍有现症患者36万多，目前仍是严重影响我国人民身心健康和国民经济、社会发展的主要疾病之一。血吸虫病的主要危害是虫卵肉芽肿病变，CD4⁺T细胞是形成肉芽肿的必需因素，辅助性T细胞1型（T help cell1，Th1）和辅助性T细胞2型（T help cell2，Th2）均为血吸虫肉芽肿反应中的重要免疫细胞。一般认为血吸虫感染早期主要引起Th1优势应答并与急性期肉芽肿病变的诱导形成密切相关；虫体排卵后则表现为Th2优势应答，在慢性期肉芽肿病变及免疫调节中起重要作用。辅助性T细胞17（T help cell17，Th17）是近来发现的一类新型的CD4⁺T效应细胞，又称炎性辅助T细胞（inflammatory T help cell，Thi），具有强大的促炎作用，在多种慢性炎性疾病和自身免疫性疾病的致病中发挥关键作用。转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）和白介素6（interleukin6，IL-6）是初始CD4⁺T细胞分化为Th17的必需因子，信号转导及转录激活子3（signal transducer andactivator of transcription3，STAT3）和孤核受体RORγt（retinoic acid-related orphanreceptorγt，RORγt）、RORα是其分化的关键性转录因子，白介素23（interleukin23，IL-23）是维持Th17存活的重要因子，缺少IL-23不影响Th17的产生，但Th17不能扩增和存活。IL-17是Th17细胞的主要效应因子，IL-17受体广泛分布于多种细胞表面。IL-17可以诱导多种炎症介质的分泌（特别是与中性粒细胞增殖、成熟、趋化有关的趋化因子），因而被认为是促进炎症的细胞因子。IL-17与受体结合后可以诱导释放炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-6、G-CSF、GM-CSF）和趋化因子（CXCL1、CXCL2、IL-8、CCL2、 CCL7），介导炎性细胞的浸润及组织损伤；此外，IL-17还与其它炎症因子（如TNF-α，IL-6等）具有协同效应，放大其促炎效应。研究发现，Th1细胞的代表因子IFN-γ和Th2细胞的代表因子IL-4对Th17的分化均有抑制作用。众所周知，在血吸虫感染过程中IFN-γ和IL-4的水平升高出现在感染过程的不同时段，因此Th17细胞的分化可能受到严格地控制，这也许是Th17/IL-17在血吸虫感染中的作用直到近几年才被发现的原因。Rutitzky等人发现SEA/CFA免疫C57BL/6小鼠后再感染曼氏血吸虫，肝脏肉芽肿炎症明显加重，这种免疫病理的恶化与小鼠体内高水平的IL-17有关，中和IL-17后其肉芽肿病变明显减轻；SEA/CFA免疫IL-23p19^-/-小鼠（不能产生IL-23），其肝脏肉芽肿病变明显轻于野生型，且与小鼠肝组织IL-17水平降低及趋化因子下调导致的中性粒细胞减少有关，由此可见IL-23是加重肉芽肿炎症反应的关键因素。日本血吸虫的致病机制虽然与曼氏血吸虫基本相同，但日本血吸虫产卵量约为曼氏血吸虫的10倍，常成簇沉积于组织内，致病能力明显比曼氏血吸虫强，感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠即可产生强烈的肉芽肿反应，在这些动物模型中研究Th17/IL-17的功能和作用，可以排除免疫这一过程所产生的影响，更真实地反映自然感染时Th17/IL-17与虫卵肉芽肿之间的关系；而且，以往研究表明相同宿主分别感染两种不同的血吸虫后，对相同细胞因子调节的反应不同，迄今为止，Th17/IL-17在日本血吸虫肉芽肿病变形成和发展中的作用未见文献报道，因此，采用日本血吸虫感染模型研究Th17/IL-17在肝脏肉芽肿病变中的作用，对进一步阐明日本血吸虫虫卵肉芽肿病变的免疫调节机制、寻找控制肉芽肿病变的新途径至关重要。本研究分为3个部分：一、C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后IL-17的动态表达及肝脏肉芽肿炎症的动态变化。二、日本血吸虫感染C57BL/6小鼠体内IL-17的细胞来源及IL-17受体分布。三、中和小鼠体内IL-17对肝脏肉芽肿病变的影响及其机制。一、C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后IL-17的动态表达及肝脏肉芽肿炎症的动态变化。建立日本血吸虫人工感染C57BL/6小鼠模型，分别于感染后0、2、4、6、8、10、12w剖杀，加入SEA（50μg/ml）体外培养肠系膜淋巴结、脾脏细胞48h，ELISA检测培养上清细胞因子IL-17、IFN-γ、IL-4动态变化；实时荧光定量PCR检测肝脏组织IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-21、IL-6、IL-23及TGF-β及趋化因子CXCL1、CXCL2、CCL11、MCP-1动态变化；HE染色检测肝脏组织的肉芽肿炎症反应的动态变化；赖氏法检测小鼠血清中ASL/ALT，观察小鼠肝脏损伤的动态变化。结果表明C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后，IL-17蛋白的表达在肉芽肿炎症的局部、引流的淋巴结及动物的全身（脾脏细胞的培养上清）均明显升高。肝脏组织中IL-17mRNA和蛋白表达在感染后4w（血吸虫成虫开始产卵）均明显增加，6w达到高峰，到8w仍维持在较高水平，其表达水平的动态变化与肝脏肉芽肿炎症的病变程度在时间上基本平行，提示IL-17的表达可能与肉芽肿炎症形成密切相关；同时Th17细胞分化调节的相关因子（IL-6、TGF-β、IL-23和IL-21）和IL-17下游效应分子（CXCL1、CXCL2和MCP-1）的动态表达也与肝脏炎症在时间上有很好的重叠性，为Th17/IL-17可能参与、调节肉芽肿病变提供了有力的证据。二、日本血吸虫感染C57BL/6小鼠体内IL-17的细胞来源及IL-17受体分布。建立日本血吸虫人工感染C57BL/6小鼠模型，于感染后6-8w剖杀，分离肝脏肉芽肿细胞、肠系膜淋巴结细胞和脾脏细胞，加入SEA、PMA、离子霉素和BFA体外刺激培养，采用流式细胞术检测分泌IL-17的CD4⁺T细胞，结果表明：脾脏细胞中几乎检测不到表达IL-17的CD4⁺T（<0.1%），肠系膜淋巴结及肝脏肉芽肿细胞中表达IL-17的CD4⁺T细胞数量极少（分别为0.12±0.03%，0.21±0.036%）；远远低于表达IFN-γ和IL-4的CD4⁺T细胞；但是，在培养基中加入IL-23（100ng/ml）后，除了脾脏细胞外，肠系膜淋巴结细胞和肝脏肉芽肿细胞中表达IL-17的CD4⁺T细胞数量明显增加（0.41±0.05%，4.79±0.55%）；肉芽肿细胞中表达IL-17的CD4⁺T细胞数高于肠系膜淋巴结中的CD4⁺T，可见IL-23对于Th17细胞的体外存活及IL-17的分泌至关重要。分离肝脏肉芽肿细胞，标记FITC-Ly6G/PE-IL-17和FITC-F4/80/PE-IL-17，采用激光共聚焦显微镜可以检测到少量的表达IL-17的巨噬细胞和中性粒细胞。采用免疫组织化学检测肝脏病理切片中表达IL-17受体的细胞，根据细胞形态初步判断大部分为成纤维细胞。三、中和小鼠体内IL-17对肝脏肉芽肿病变的影响及其机制。Th17/IL-17在自身免疫性疾病的致病中扮演重要角色，从多发性硬化（MS）、类风湿关节炎（RA）患者及其实验动物模型的外周血分离出的单个核细胞和局部病灶均高表达IL-17，且IL-17的表达水平与疾病的严重程度密切相关。为了进一步明确Th17/IL-17在日本血吸虫感染小鼠肝脏肉芽肿病变中的作用，我们在小鼠感染后第24d开始注射IL-17中和抗体或同型抗体，50μg/次/只，每隔3d一次，共5次，末次抗体注射后48h剖杀小鼠，观察C57BL/6感染小鼠体内IL-17被中和后对肉芽肿炎症反应及肝脏损伤的影响；并采用HE染色、RT-qPCR、ELISA、FACS、免疫组化等技术从细胞、分子水平分析其机制。结果表明：肉眼可见IL-17中和抗体处理组小鼠肝脏的肉芽肿炎症反应明显减轻； HE染色的肝脏病理切片显示中和IL-17后，肝脏肉芽肿面积显著小于同型对照组（40.70±34.20×10³μm²vs64.28±38.65×10³μm²，P＜0.001）；肝细胞坏死明显减轻，血清中转氨酶（AST/ALT）水平也相应下降；但是中和IL-17对感染小鼠的虫荷、卵荷、肝脏及脾脏系数没有明显影响；IL-17中和抗体处理组小鼠肝脏组织中炎症因子IL-6，以及趋化因子CXCL1、CXCL2mRNA及蛋白水平均明显下调，而IL-10mRNA上调，但TNF-α、MCP-1和CCL11的mRNA水平在两组之间无统计学差异；FACS分析显示中和抗体组小鼠的肝脏肉芽肿细胞中CD19⁺（B细胞）,和CD3⁺（T细胞）与对照组无明显差别；CD11b⁺/Ly-6G⁺中性粒细胞的含量减少（7.69±0.77×10⁶vs11.19±1.76×10⁶，P<0.05）与趋化因子CXCL1及CXCL2水平下调相一致；而F4/80+（巨噬细胞）明显高于对照组（6.59±0.38×10⁶vs5.60±0.39×10⁶，P<0.01）；细胞免疫组织化学检测肝脏病理切片的MPO（主要由激活的中性粒细胞分泌和表达），结果显示中和抗体组小鼠的MPO阳性染色面积明显低于对照组（6.96±2.0%vs3.86±1.08%，P<0.05），进一步佐证了FACS的结果；ELISA检测肉芽肿细胞培养上清，结果显示中和抗体组小鼠的肉芽肿细胞分泌的IFN-γ和IL-4均低于同型抗体对照组，且两组之间具有显著性差异，IFN-γ的降低比IL-4更明显；中和抗体组小鼠肠系膜淋巴结及脾脏细胞的培养上清IFN-γ和IL-4的均值也低于对照组，但两组之间的差别无统计学差异。因此，中和感染日本血吸虫小鼠体内的IL-17可以减轻小鼠的急性期肝脏肉芽肿病变，减轻肝细胞坏死；这种保护作用与促炎的细胞因子、趋化因子的下调及减少的炎性细胞（中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸粒细胞等）的浸润有关；上调IL-10，抑制Th1/Th2反应，可能是中和IL-17、减轻肉芽肿炎症反应另一机制。总之，本研究首次描述了C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后细胞因子IL-17及其相关分子的动态变化；IL-17的表达水平与肝脏肉芽肿炎症的严重程度密切相关；感染小鼠体内IL-17来源于CD4⁺T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞；肉芽肿周围的成纤维细胞表达IL-17受体；Th17/IL-17通过诱导炎性细胞因子、趋化因子的分泌将炎性细胞招募至炎症反应位点，从而促进肉芽肿炎症反应。本研究表明血吸虫感染除了诱导Th1、Th2细胞外，还能特异地诱导Th17细胞的分化；Th17与Th1、Th2细胞一样，都是参与虫卵肉芽肿形成和发展的重要的CD4⁺T效应细胞；尽管Th17细胞数量在肉芽肿CD4⁺T细胞中有限，但是它可能在肉芽肿病变的细胞因子的调节网络中扮演重要角色，除了诱导促进炎症的细胞因子、趋化因子的表达和中性粒细胞的趋化，IL-17可能通过调节Th1/Th2细胞，促进肉芽肿反应（该机制在自身免疫病和缺血再灌注损伤模型中已有报道）；对IL-17的动态描述，完善了日本血吸虫感染小鼠模型中Th细胞因子的变化规律，丰富了血吸虫肉芽肿病变的免疫调节机制，靶向Th17/IL-17的治疗可能成为减轻、治疗血吸虫虫卵肉芽肿病变的有效途径。